腸炎沖劑調(diào)節(jié)胃腸功能及止瀉作用的動物實(shí)驗(yàn)研究

丁海峰,曹永兵,劉洪濤,牟 斌,姜遠(yuǎn)英(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一組與自身免疫相關(guān)的腸道炎癥性疾病,好發(fā)于乙狀結(jié)腸和直腸。臨床癥狀以腹痛、腹瀉、黏液、膿血便和里急后重為主,發(fā)病機(jī)制尚不明確,病程纏綿,反復(fù)發(fā)作,是胃腸道的疑難病。近年來,其發(fā)病率呈明顯上升趨勢,但目前尚無特異性治療方法[1]。臨床主要采用激素和水楊酸制劑治療,癥狀嚴(yán)重時合用抗生素,由于嚴(yán)重不良反應(yīng)的存在,均無法長期用藥,因此開發(fā)新的安全有效的治療藥物顯得十分迫切。腸炎沖劑是由黃柏、地錦草等制成的復(fù)方制劑,臨床應(yīng)用于治療UC多年。本研究進(jìn)一步證實(shí)了腸炎沖劑對實(shí)驗(yàn)動物胃腸的調(diào)節(jié)功能及止瀉作用。

1 材料和方法

1.1 儀器 張力換能器和PowerLab數(shù)據(jù)記錄與分析系統(tǒng)(澳大利亞AD Instruments公司);麥?zhǔn)显〔?江蘇省張家港市青松生物醫(yī)學(xué)儀器有限公司);Lambda25型可見-紫外分光光度計(jì)(美國PerkinElmer公司)。

1.2 試劑和藥品 番瀉葉(上海雷允上中藥飲片廠);蓖麻油(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部自制,批號020909);鹽酸小檗堿(上海利生制藥廠,批號Y-001-0001);羧甲基纖維素鈉(CMCNa,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司,批號F20050913,用蒸餾水配成所需濃度);阿托品注射液(上海禾豐制藥有限公司,批號020101,用0.5%CMCNa配成0.01 mg/ml的溶液);甲硫酸新斯的明注射液(規(guī)格:0.5 mg/ml,上海信誼金朱藥業(yè)有限公司,批號020401);氯化乙酰膽堿(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司,批號 20020122,用三蒸水配成0.4 mg/ml的溶液);酚紅(上海三愛思試劑有限公司,批號990122,用 2%CMCNa配成0.7 mg/L溶液)。腸炎沖劑由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室自制,用0.5%CMCNa碾磨混懸均勻,分別配成1.14 、0.57、0.29 g生藥/ml的藥液。

1.3 動物 SD大鼠[清潔級,第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,動物合格證號:SCXK(滬)2002-0006],雌雄各半,體重250～300 g;ICR小鼠[清潔級,中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心,動物合格證號:SCXK(滬)2002-0010],雌雄不限,體重18～22 g;白色家兔[第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,動物合格證號:SCXK(滬)2005-0003],雌雄各半,體重1.8～2.2 kg。

1.4 大鼠正常小腸推進(jìn)運(yùn)動的實(shí)驗(yàn)[2]取50只SD大鼠,按體重以數(shù)字化隨機(jī)法分為5組,各組給藥體積均為10 ml/kg體重。腸炎沖劑高、中、低劑量組分別灌胃給予1.14、0.57、0.29 g生藥/ml的腸炎沖劑溶液,即高、中、低劑量組的給藥劑量分別為11.4、5.7、2.9 g生藥/kg體重?？瞻讓φ战M灌胃給予0.5%CMCNa溶液,陽性對照組灌胃給予0.01 mg/ml的阿托品溶液。每天給藥1次,連續(xù)3 d,進(jìn)行碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)前,大鼠禁食過夜。末次給藥1 h后,灌胃給予活性炭混懸液(用0.5%CMCNa配成0.1 g/ml混懸液)10 ml/kg體重,30 min后斷頸處死大鼠,打開腹腔,分離腸系膜,剪取幽門至回盲部的腸管置于托盤上,輕輕將小腸拉成直線,測量腸管長度作為小腸總長度。以幽門至炭末前沿的距離作為炭末在腸內(nèi)推進(jìn)距離,計(jì)算炭末推進(jìn)百分率和藥物的抑制率。炭末推進(jìn)百分率=[炭末在腸內(nèi)推進(jìn)距離/小腸總長度]×100%,藥物的抑制率=[(空白對照組炭末推進(jìn)百分率-給藥組炭末推進(jìn)百分率)/空白對照組炭末推進(jìn)百分率]×100%。

1.5 小鼠推進(jìn)機(jī)能亢進(jìn)小腸運(yùn)動的實(shí)驗(yàn)[2]取ICR小鼠 60只,雌雄各半,按體重以數(shù)字化隨機(jī)法分為6組,各組給藥體積均為15 ml/kg體重。給藥組分別灌胃給予1.14、0.57、0.29 g生藥/ml的腸炎沖劑溶液,則給藥劑量分別為17.1、8.6、4.3 g生藥/kg體重。模型對照組和空白對照組均灌胃給予0.5%CMCNa,陽性對照組灌胃給予0.01 mg/ml的阿托品溶液,每天給藥 1次,連續(xù)3 d。末次給藥1 h后,除空白對照組外,其余各組均皮下注射新斯的明0.1 g/kg體重造模,15 min后進(jìn)行炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn),計(jì)算炭末推進(jìn)百分率和藥物的抑制率。炭末推進(jìn)百分率計(jì)算與1.4項(xiàng)下相同。藥物的抑制率=[(模型對照組炭末推進(jìn)百分率-給藥組炭末推進(jìn)百分率)/模型對照組炭末推進(jìn)百分率]×100%。

1.6 家兔離體十二指腸平滑肌活動的實(shí)驗(yàn)[3,4]取家兔40只,雌雄各半,按體重以數(shù)字化隨機(jī)法分為5組,即空白對照組、陽性對照組(阿托品)及腸炎沖劑高、中、低劑量組,每組8只。所有家兔在實(shí)驗(yàn)前禁食24 h,擊頭致死,立即剖腹,取出一段十二指腸,迅速于冷臺氏液中保存。實(shí)驗(yàn)時剪取1.5 cm腸段,懸吊在37℃、39 ml臺氏液的麥?zhǔn)显〔壑?pH值7.2～7.4),通100%氧氣,靜息張力0.5 g,平衡0.5 h后開始實(shí)驗(yàn),以張力換能器測定肌內(nèi)收縮力,用PowerLab進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄與分析。(1)對家兔離體十二指腸平滑肌自發(fā)活動的影響 按上述操作后,描記正常收縮曲線,各組分別加入1.14、0.57、0.29 g生藥/ml腸炎沖劑藥液,阿托品溶液和0.5%CMCNa各1 ml,描記加藥后的收縮曲線。(2)對氯化乙酰膽堿所致腸痙攣的影響 按上述操作常規(guī)制備家兔離體腸標(biāo)本,描記正常收縮曲線,然后在浴槽內(nèi)加入0.4 mg/ml氯化乙酰膽堿0.2 ml(終濃度為2 μ g/ml),引起腸管痙攣,待其平穩(wěn)后,向浴槽內(nèi)分別加入1.14、0.57、0.29 g生藥/ml腸炎沖劑藥液、阿托品溶液和0.5%CMCNa各1 ml,描記加藥后收縮曲線。

1.7 大鼠胃排空實(shí)驗(yàn)[5]取SD大鼠40只,按體重以數(shù)字化隨機(jī)法分為5組,各組給藥體積均為10 ml/kg體重。空白對照組灌胃給予0.5%CMCNa溶液,陽性對照組灌胃給予1 mg/ml的阿托品溶液,腸炎沖劑高、中、低劑量組分別每天灌胃給予1.14、0.57、0.29 g生藥/ml的腸炎沖劑藥液,連續(xù)3 d。胃排空實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食過夜。末次給藥后2 h,每只大鼠灌胃給予0.07%酚紅溶液1.5 ml,15 min后處死大鼠,立即取胃,將胃內(nèi)容物洗在10 ml蒸餾水中,3.0×103g離心 10 min,取上清液在546 nm波長測定吸光度。另取10 ml蒸餾水加入0.07%酚紅溶液1.5 ml,離心后測定其546 nm的吸光度作為基礎(chǔ)值,計(jì)算胃內(nèi)酚紅殘留率。胃內(nèi)酚紅殘留率=(各組 A546值/基礎(chǔ) A546值)×100%。

1.8 止瀉實(shí)驗(yàn)[6](1)番瀉葉致瀉實(shí)驗(yàn) 造模前1 d用番瀉葉25 g加水300 ml,直火煎煮15 min,用紗布過濾,在水浴鍋上濃縮成1 g/ml溶液備用。取ICR小鼠60只,雌雄各半,按體重以數(shù)字化隨機(jī)法分為6組,各組給藥體積均為15 ml/kg體重?？瞻讓φ战M和模型對照組灌胃給予0.5%CMCNa溶液,陽性對照組 予1.0的 酸 檗堿,腸炎沖劑高、中、低劑量給藥組分別灌胃給予濃度為1.14、0.57、0.29 g生藥/ml的腸炎沖劑藥液,即給藥劑量分別為17.1、8.6、4.3 g生藥/kg體重,連續(xù)5 d。除空白對照組外,各組于末次給藥后1 h口服番瀉葉煎液0.02 ml/g體重。每鼠單籠放置,籠底墊干凈濾紙,每小時換1次紙,計(jì)數(shù)5 h內(nèi)干糞數(shù)和濕糞數(shù),計(jì)算稀便率。稀便率=(稀便數(shù)/總便數(shù))×100%。(2)蓖麻油致瀉實(shí)驗(yàn) 另取 ICR小鼠 60只,雌雄各半,按體重以數(shù)字化隨機(jī)法分為6組。各組給藥劑量與番瀉葉致瀉實(shí)驗(yàn)相同,每天給藥1次,連續(xù)5 d。除正常對照組外,其余各組均于末次給藥后1 h口服蓖麻油0.02 ml/g體重,記錄糞便數(shù)量并計(jì)算稀便率。

2 結(jié) 果

2.1 對正常大鼠小腸推進(jìn)運(yùn)動的影響 空白對照組平均炭末推進(jìn)百分率為(72.01±5.77)%,腸炎沖劑高、中、低劑量組和陽性對照組(阿托品)的平均炭末推進(jìn)百分率為(53.93±5.71)%、(65.98±7.94)%、(68.10±6.98)%和(66.24±5.61)%,抑制率分別為25.11%、8.37%、5.43%和8.01%。腸炎沖劑高、中劑量組和陽性對照組的炭末推進(jìn)百分率與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.001),表明高、中劑量的腸炎沖劑和阿托品均能顯著抑制大鼠正常小腸的推進(jìn)運(yùn)動。腸炎沖劑低劑量組的炭末推進(jìn)百分率與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍顯示抑制趨勢。

2.2 對小鼠推進(jìn)機(jī)能亢進(jìn)小腸運(yùn)動的影響 腸炎沖劑對ICR小鼠推進(jìn)機(jī)能亢進(jìn)小腸運(yùn)動的影響實(shí)驗(yàn)中,空白對照組和模型對照組的平均炭末推進(jìn)百分率分別為(66.29±16.04)%和(77.46±13.94)%,腸炎沖劑高、中、低劑量組和陽性對照組(阿托品)的平均炭末推進(jìn)百分率分別為(54.98±7.07)%、(69.20±7.25)%、(70.79±10.98)%和(74.79±15.38)%,藥物的抑制率分別為29.02%、10.66%、8.61%和 3.45%。皮下注射新斯的明0.1 g/kg體重能引起ICR小鼠小腸推進(jìn)機(jī)能亢進(jìn)。腸炎沖劑高劑量組的炭末推進(jìn)百分率與模型對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明高劑量的腸炎沖劑能顯著抑制新斯的明導(dǎo)致的推進(jìn)機(jī)能亢進(jìn)小腸的運(yùn)動機(jī)能,腸炎沖劑中、低劑量組及陽性對照組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍有抑制推進(jìn)機(jī)能亢進(jìn)小腸運(yùn)動的趨勢。

2.3 對家兔離體十二指腸平滑肌活動的影響 陽性對照組和腸炎沖劑高、中劑量組對家兔平滑肌自發(fā)活動的收縮張力與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明阿托品和高、中劑量的腸炎沖劑能顯著抑制家兔離體十二指腸段自發(fā)活動。陽性對照組和腸炎沖劑高、中劑量組對氯化乙酰膽堿所致腸痙攣的收縮張力與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明腸炎沖劑和阿托品均能顯著抑制氯化乙酰膽堿所致腸痙攣,結(jié)果見表1。

表1 腸炎沖劑對家兔離體十二指腸平滑肌收縮張力的影響Table 1 The effect of Changyan granules on contraction tension of isolated duodenal smooth muscle in rabbits

表1 腸炎沖劑對家兔離體十二指腸平滑肌收縮張力的影響Table 1 The effect of Changyan granules on contraction tension of isolated duodenal smooth muscle in rabbits

*P＜0.05,***P＜0.001,與空白對照組比較

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2.4 對大鼠胃排空的影響 空白對照組和陽性對照組大鼠的胃內(nèi)殘留率分別為(46.79±32.13)%和(97.06±24.96)%,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P＜0.01),說明10 mg/kg體重的阿托品能顯著抑制大鼠的胃排空功能。腸炎沖劑高、中、低劑量組的胃內(nèi)殘留率分別為(40.33±25.94)%、(27.75±10.96)%和(36.06±18.24)%,與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明各劑量的腸炎沖劑對SD大鼠的胃排空功能沒有影響。

2.5 止瀉效果 (1)對番瀉葉致瀉的止瀉效果 空白對照組未見稀便,模型對照組的稀便率為(80.11±14.99)%,表明番瀉葉煎液能誘導(dǎo)小鼠腹瀉。陽性對照組(鹽酸小檗堿)和腸炎沖劑高劑量組的稀便率分別為(51.43±23.61)%和(60.15±15.95)%,與模型對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腸炎沖劑中、低劑量組的稀便率分別為(73.34±13.75)%和(71.36±16.08)%,與模型對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍有止瀉趨勢,并呈一定的劑量相關(guān)性。(2)對蓖麻油致瀉的止瀉效果 空白對照組未見稀便,模型對照組的稀便率為(81.44±14.23)%,表明蓖麻油致瀉造模成功。腸炎沖劑高、中、低劑量組和陽性對照組的稀便率分別為(72.51±17.13)%、(71.01±13.20)%、(76.86±17.08)%和(71.03±10.43)%,與模型對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,稀便率與劑量的相關(guān)性也不明顯。

3 討 論

近年來,中醫(yī)藥治療UC取得一定進(jìn)展,但療效好的內(nèi)服中藥較少。腸炎沖劑是在民間驗(yàn)方基礎(chǔ)上經(jīng)刪改而成的復(fù)方制劑,其中的黃柏、地錦草等具有抗菌、抗炎、抗?jié)?以及免疫調(diào)節(jié)作用,臨床常用于治療腸炎、菌痢等疾病。以往的研究表明,腸炎沖劑能夠明顯緩解UC模型大鼠的腹瀉癥狀,降低結(jié)腸組織髓過氧化物酶活力,改善結(jié)腸組織病理學(xué)改變,使?jié)兠娣e明顯縮小,緩解水腫[7]。本研究結(jié)果表明,腸炎沖劑對大鼠正常小腸及推進(jìn)機(jī)能亢進(jìn)小鼠的小腸運(yùn)動均有明顯抑制作用,能顯著抑制離體家兔十二指腸平滑肌的收縮運(yùn)動和氯化乙酰膽堿所致腸痙攣,可能由于藥方中含有的黃柏堿成分具有輕度的筒箭毒樣作用,能抑制由乙酰膽堿引起的收縮反應(yīng)。止瀉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腸炎沖劑對番瀉葉所致的小鼠腹瀉有止瀉作用,但對蓖麻油引起的腹瀉無明顯效果。分析原因可能與蓖麻油除了刺激小腸,增加腸蠕動,促進(jìn)排泄外,還具有一定的潤腸作用有關(guān)。此外,腸炎沖劑對胃功能未見明顯影響。總之,本研究結(jié)果為腸炎沖劑的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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