骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的鑒定指標(biāo)

馬新喆，張娟娟，呂 洋(綜述)，王海萍(審校)

(河北北方學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 張家口 075000)

近些年來(lái)，心血管疾病越來(lái)越引起人們的重視，隨著生活節(jié)奏的加快，死于心血管疾病的人數(shù)日益增加，心肌梗死、心力衰竭等成為常見(jiàn)病。心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞[1-2]?，F(xiàn)有的醫(yī)療水平和治療方法無(wú)法從根本上修復(fù)壞死的心肌細(xì)胞，如何改善心肌功能，提高心肌效率，從細(xì)胞水平上預(yù)防和治療疾病，成為一項(xiàng)重要的課題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向心肌分化的潛能，使得BMSCs成為細(xì)胞移植治療心肌損傷最有前途的細(xì)胞來(lái)源之一[3-4]。誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細(xì)胞成為國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)多種誘導(dǎo)劑能作用于BMSCs使其分化為心肌樣細(xì)胞[5-6]。本文對(duì)研究BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行綜述。

1 結(jié)蛋白與α肌動(dòng)蛋白

結(jié)蛋白與α肌動(dòng)蛋白作為心肌細(xì)胞分化的早期標(biāo)志已經(jīng)得到了公認(rèn)，是目前用來(lái)特異性檢測(cè)心肌細(xì)胞應(yīng)用次數(shù)最多也是最普遍的指標(biāo)。結(jié)蛋白是最早表達(dá)于未分化的肌母細(xì)胞中的肌源性蛋白，在肌源性細(xì)胞發(fā)育、成熟的過(guò)程中起重要作用，能夠維持肌纖維形態(tài)，連接細(xì)胞核與細(xì)胞膜，從而使肌小節(jié)之間發(fā)生信號(hào)聯(lián)系。α肌動(dòng)蛋白是肌動(dòng)蛋白的一種亞型，是骨骼肌和心肌中具有特異性收縮功能的細(xì)胞骨架蛋白，為胎兒或新生兒心室肌的主要成分。指導(dǎo)α肌動(dòng)蛋白組織特異性表達(dá)的是α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是心肌細(xì)胞高表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，在心肌細(xì)胞或心肌組織中高效表達(dá)，在其啟動(dòng)子區(qū)域有轉(zhuǎn)錄因子的特定結(jié)合序列，表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Klug等[7]采用人類α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子來(lái)篩選純化人類胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞，得到了99%純的心肌細(xì)胞。

結(jié)蛋白和α肌動(dòng)蛋白的表達(dá)陽(yáng)性說(shuō)明BMSCs發(fā)生了肌源性分化。華聲瑜等[8]通過(guò)研究丹酚酸B對(duì)大鼠BMSCs分化過(guò)程中結(jié)蛋白、α肌動(dòng)蛋白信使RNA表達(dá)的影響的結(jié)果顯示，5-氮胞苷組和5-氮胞苷+丹酚酸B組各樣本中均出現(xiàn)明確的心肌早期分化基因；與5-氮胞苷組相比，5-氮胞苷+丹酚酸B組的結(jié)蛋白和α肌動(dòng)蛋白信使RNA的表達(dá)顯著增加，中藥單體丹酚酸B對(duì)BMSCs向心肌細(xì)胞的分化具有一定的誘導(dǎo)或促進(jìn)作用。

2 肌鈣蛋白

肌鈣蛋白是一種調(diào)節(jié)蛋白，分子呈球形，包括三個(gè)亞單位：肌鈣蛋白I是抑制亞單位，可抑制肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，阻止肌肉收縮；肌鈣蛋白C是鈣離子受體，與Ca2+結(jié)合，活化細(xì)肌絲，相對(duì)分子質(zhì)量為18×103；肌鈣蛋白T能將肌鈣蛋白附著在原肌球蛋白上，使原肌球蛋白與肌鈣蛋白結(jié)合成原肌球蛋白-肌鈣蛋白復(fù)合物，并附著在肌動(dòng)蛋白雙股螺旋狀的縱溝內(nèi)[9]。肌肉的調(diào)節(jié)由Ca2+介導(dǎo)，影響到肌動(dòng)蛋白、甲胎蛋白酶的活性與肌球蛋白結(jié)合的效果。

肌鈣蛋白I為單一多肽鏈，其相對(duì)分子質(zhì)量隨各亞型不同而異。肌鈣蛋白I有三種亞型，由不同的基因編碼，分別定位于骨骼肌快肌、慢肌以及心肌中。心肌肌鈣蛋白I(cardiac-specific troponin I，cTnI)以兩種形式存在于心肌細(xì)胞內(nèi)：小部分(約3%)游離于胞質(zhì)中，為可溶性；大部分以結(jié)構(gòu)蛋白的形式固定于肌原纖維上，為不可溶性。正常人血液中cTnI的水平一般<0.3 μg/L，當(dāng)肌細(xì)胞受到損傷時(shí)，游離的cTnI先釋放入血，隨著損傷加重，結(jié)合部分的cTnI被降解從而不斷釋放入血，導(dǎo)致血中cTnI持續(xù)升高。研究表明，成人的骨骼肌組織在任何階段中都不表達(dá)cTnI，也不因任何病理刺激表達(dá)肌鈣蛋白[10]。所以，cTnI有較高的心肌特異性，是檢測(cè)心肌損傷和鑒定心肌源性細(xì)胞的特異性生化標(biāo)志物，其表達(dá)陽(yáng)性可以說(shuō)明BMSCs發(fā)生心肌轉(zhuǎn)化。張宇等[11]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀復(fù)合物，呈陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組呈弱陽(yáng)性或陰性，從而確定5-氮胞苷能夠誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

3 間隙連接蛋白43

心肌細(xì)胞的縫隙連接是心臟電生理一致性的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。間隙連接蛋白43(connexin-43，Cx43)主要存在于心房和心室肌細(xì)胞連接處，在正常心臟組織細(xì)胞中表達(dá)。Cx43參與細(xì)胞間縫隙連接，是分化細(xì)胞與宿主細(xì)胞形成興奮收縮耦聯(lián)同步的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)。Cx43基因DNA長(zhǎng)約2768 bp，其中開(kāi)放讀碼框?yàn)?146 bp，編碼378個(gè)氨基酸的單肽，因其相對(duì)分子質(zhì)量約為43×103，故命名為Cx43。Cx43是心肌細(xì)胞縫隙連接的特征性蛋白，其表達(dá)陽(yáng)性說(shuō)明心肌間閏盤(pán)的形成[12]。Cx43對(duì)于細(xì)胞間化學(xué)信息的交流和電沖動(dòng)的傳導(dǎo)，維持電活動(dòng)和機(jī)械收縮、舒張功能的同步性，以及心肌功能的保持非常重要，是目前檢測(cè)心肌閏盤(pán)的常用指標(biāo)。賈敏等[13]在研究BMSCs分離培養(yǎng)及向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)cTnT和Cx43表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明分化的細(xì)胞具有心肌細(xì)胞特性。

4 肌細(xì)胞增強(qiáng)子2

肌細(xì)胞增強(qiáng)子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MADS-Box家族，是一種特定的轉(zhuǎn)錄因子。在脊椎動(dòng)物中，MEF2家族的轉(zhuǎn)錄因子有四個(gè)成員，分別是MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。MEF2蛋白的結(jié)構(gòu)分為N端和C端，其N端在不同物種中幾乎相同，都含有一個(gè)MADS-Box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)直接與其相鄰的MEF2結(jié)構(gòu)域。MADS-Box是由57個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)構(gòu)域，不同脊椎動(dòng)物中具有高度保守性。MEF2結(jié)構(gòu)域由MADS-Box附近的29個(gè)氨基酸組成，是MEF2因子所特有的結(jié)構(gòu)域[14]。MEF2C在心臟發(fā)育中表達(dá)，并且作為心臟特異性的轉(zhuǎn)錄因子參與心臟發(fā)育的各個(gè)過(guò)程，調(diào)節(jié)心臟特異性基因的表達(dá)。MEF2C與其他成員相比，其表達(dá)組織特異性比較顯著。

5 心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4

GATA是一種組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族。脊椎動(dòng)物有6個(gè)GATA轉(zhuǎn)錄因子，其中心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA-4在心臟發(fā)育最早期表達(dá)，是調(diào)控心肌基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與了心臟正常發(fā)育、功能基因表達(dá)和心肌肥大的病理過(guò)程，是心肌前體細(xì)胞最早的標(biāo)志之一。人類GATA-4基因是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，能結(jié)合共同序列(A/T)GATA(A/G)。GATA-4位于人類染色體8p23.1～p22，總長(zhǎng)度為55 757 bp，有7個(gè)外顯子，cDNA全長(zhǎng)3372 bp，編碼序列全長(zhǎng)1329 bp。文通等[15]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs轉(zhuǎn)染microRNA-1后，心肌重要轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和MEF2C表達(dá)逐漸上調(diào)，轉(zhuǎn)染后6 d，心肌特異性蛋白cTnI表達(dá)呈陽(yáng)性，結(jié)果表明，microRNA-1能誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。

6 心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Csx/Nkx2.5

Csx/Nkx2.5是背側(cè)中胚層形成所必需的，它在心肌開(kāi)始分化前即開(kāi)始表達(dá)，是所有脊椎動(dòng)物心臟發(fā)生中最早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，即心臟前體細(xì)胞最早的標(biāo)志物。隨著對(duì)心臟發(fā)育機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)MEF2C、Csx/Nkx2.5和GATA-4等轉(zhuǎn)錄因子可以作為心臟細(xì)胞分化過(guò)程中特異性的標(biāo)志[16]。Vincentz等[17]的研究證實(shí)，Nkx2.5是心肌發(fā)育過(guò)程中起決定性作用的基因，MEF2C與Nkx2.5之間的相互作用對(duì)心臟(尤其是心室)發(fā)育至關(guān)重要。

伍長(zhǎng)學(xué)等[18]的研究結(jié)果驗(yàn)證了電學(xué)因素在心臟發(fā)育過(guò)程中具有重要意義的理論假設(shè),該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在各時(shí)間點(diǎn)5-氮胞苷誘導(dǎo)+電刺激組GATA-4、NKx2.5 和MEF2C基因表達(dá)量顯著高于單純5-氮胞苷誘導(dǎo)組，且兩組的表達(dá)規(guī)律相似；通過(guò)蛋白定量分析發(fā)現(xiàn)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)前組肌鈣蛋白I、結(jié)蛋白、Cx43顯著高于后組，通過(guò)這種對(duì)應(yīng)關(guān)系，推測(cè)GTAT-4、NKx2.5和MEF2C基因參與調(diào)控心肌細(xì)胞的形成過(guò)程，而電刺激通過(guò)上調(diào)GATA-4、NKx2.5和MEF2C基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肌鈣蛋白I、結(jié)蛋白和Cx43蛋白的表達(dá)和心肌細(xì)胞的形成。

7 超極化激活的核酸環(huán)化酶門(mén)控的離子通道

心肌組織的節(jié)律性活動(dòng)(如心跳、呼吸等)均依賴于其中所含的一種能產(chǎn)生起搏電流的起搏細(xì)胞，這種電流最初由Di Francesco在20世紀(jì)80年代初研究兔竇房結(jié)起搏活動(dòng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，并稱之為特種離子流。在此之前，Noma和Irisawa已經(jīng)在研究竇房結(jié)起搏活動(dòng)時(shí)發(fā)現(xiàn)這一離子流并命名為過(guò)渡激活正離子流，現(xiàn)稱為超極化激活及環(huán)化核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道(hyperpolarization activated,cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)[19]。HCN所具有的超極化激活鈉鉀離子通道、細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸的調(diào)節(jié)及微弱的單通道電導(dǎo)等被認(rèn)為是起搏活動(dòng)所必須的獨(dú)特特征，稱為起搏電流[19]。在脊椎動(dòng)物，HCN家族中包含4個(gè)成員，即HCN1、HCN2、HCN3、HCN4。HCN4基因位于人染色體15q23～q24上，全長(zhǎng)共5065 bp，含有8個(gè)外顯子，相對(duì)分子質(zhì)量為129.1×103[20]。HCN基因家族中不同亞型的基本序列60%大體一致。HCN3特征性地僅在中樞中表達(dá)。HCN4基因的編碼產(chǎn)物HCN4蛋白由1203個(gè)氨基酸組成，包含了6個(gè)跨膜部分(S1～S6)。HCN1、HCN2和HCN4在心臟中表達(dá)豐富，而根據(jù)原位雜交分析HCN的表達(dá)在竇房結(jié)中依次為HCN4>HCN2>HCN1。因此，可以通過(guò)檢測(cè)HCN4、HCN2和起搏電流判定BMSCs分化為心肌細(xì)胞。

8 肌球蛋白重鏈

已知哺乳動(dòng)物的心臟表達(dá)兩種肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)，即α-MHC和β-MHC，這些基因表達(dá)產(chǎn)物在肌球蛋白分子中形成二聚體，存在3種分子異構(gòu)體，即Vl(A-A同二聚體)、V2(A-B異二聚體)、V3(B-B同二聚體)。MHC具有兩個(gè)生物學(xué)作用：一是具有腺苷三磷酸酶活性，裂解腺苷三磷酸，能夠有效地將高能磷酸化合物分解釋放的化學(xué)能轉(zhuǎn)變成動(dòng)能；二是具有與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的能力[21]。α-MHC見(jiàn)于胚胎型心肌細(xì)胞，而β-MHC在成熟心肌細(xì)胞中表達(dá)。β-MHC蛋白水平能夠在一定程度上反映BMSCs向心肌細(xì)胞的分化情況，其基因表達(dá)水平是觀察BMSCs向成熟心肌樣細(xì)胞分化的重要指標(biāo)之一[22]。冼紹祥等[23]在研究三七總皂苷對(duì)BMSCs增殖和向心肌樣細(xì)胞分化的影響的實(shí)驗(yàn)中，分別檢測(cè)正常大鼠心肌細(xì)胞和誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后4周細(xì)胞的α-MHC和β-MHC信使RNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)三七總皂苷、5-氮胞苷誘導(dǎo)24 h后繼續(xù)培養(yǎng)，BMSCs能表達(dá)α-MHC 和β-MHC。

9 小 結(jié)

作為判定BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的檢測(cè)指標(biāo)結(jié)蛋白，α肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白、Cx43、GATA-4等已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，隨著這些檢測(cè)指標(biāo)的應(yīng)用，為BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞提供了理論支持。然而B(niǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞仍存在如何更好分離和純化BMSCs、最佳誘導(dǎo)劑的選擇、臨床應(yīng)用的安全性以及如何提高誘導(dǎo)分化率等問(wèn)題。隨著更多誘導(dǎo)劑的發(fā)現(xiàn)以及更有效的心肌特異性檢測(cè)指標(biāo)的研究，BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的前景會(huì)越來(lái)越廣闊，干細(xì)胞移植將會(huì)給更多心腦血管疾病的患者帶來(lái)福音。

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