劉士德，陳汗英，張建華，田生禮，李水明，李慧麗，李明華，邢 苗

深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060

PSTI1可提高大腸桿菌應(yīng)答脅迫能力

劉士德，陳汗英，張建華，田生禮，李水明，李慧麗，李明華，邢 苗

深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060

指出含典型34肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域 (tetratricopeptide repeat，TPR)的脅迫誘導(dǎo)蛋白 (stress-inducible protein-1，STI1)是真核生物特有的一類(lèi)與脅迫應(yīng)答有關(guān)的分子伴侶蛋白.作者從多頭絨泡菌分離出一個(gè)STI1類(lèi)似蛋白cDNA，因其編碼蛋白含有兩個(gè)非典型的TPR結(jié)構(gòu)域，命名為PSTI1.為了解PSTI1對(duì)原核生物脅迫應(yīng)答功能的影響，觀(guān)察表達(dá)PSTI1的大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)與原菌株的增殖差異，發(fā)現(xiàn)PSTI1表達(dá)菌耐受鹽、滲透壓、重金屬離子、氧化、缺氧和酸堿變化脅迫的能力均增強(qiáng)，但對(duì)高溫敏感.PSTI1保守結(jié)構(gòu)域TPR1能提高E.coli耐受滲透壓脅迫的能力，但TPR2會(huì)使E.coli對(duì)鹽和滲透壓脅迫敏感，說(shuō)明TPR1和TPR2在PSTI1調(diào)控脅迫應(yīng)答中可能扮演不同角色.通過(guò)pull-down和質(zhì)譜分析技術(shù)檢測(cè)了與PSTI1作用的E.coli蛋白，發(fā)現(xiàn)PSTI1能與E.coli的HtpG(Hsp90)、La蛋白酶和過(guò)氧化氫酶HpII等作用，說(shuō)明PSTI1具有原核生物非典型TPR結(jié)構(gòu)域蛋白的類(lèi)似功能，是類(lèi)似STI1的脅迫應(yīng)答蛋白.

微生物細(xì)胞生物學(xué);多頭絨泡菌;STI1類(lèi)似蛋白;cDNA文庫(kù);大腸桿菌;脅迫應(yīng)答;真菌;基因工程;基因編碼

真核生物普遍存在的脅迫誘導(dǎo)蛋白 (stress-inducible protein-1，STI1)是一類(lèi)進(jìn)化保守的、調(diào)節(jié)細(xì)胞脅迫應(yīng)答的分子伴侶蛋白.STI1家族成員的共同特征是都含有2個(gè)以上的34肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(tetratricopeptide repeat domian，TPR)，TPR由3個(gè)含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)、序列長(zhǎng)度為34氨基酸 (amino acid，aa)的重復(fù)序列構(gòu)成［1］.細(xì)胞在應(yīng)答熱脅迫時(shí)，STI1通過(guò)TPR結(jié)構(gòu)與熱休克蛋白 (heat shock protein，Hsp)Hsp70和Hsp90作用［2］，調(diào)節(jié)Hsp70和Hsp90的構(gòu)像及其三磷酸腺苷酶 (adenosine triphosphatase，ATPase) 活 性［3-5］，指導(dǎo)Hsp70和Hsp90與其配體蛋白作用［4-7］，參與Hsp90 對(duì)配體蛋白生物活性的調(diào)節(jié)［4，6-7］.此外，STI1還通過(guò)Hsp復(fù)合體調(diào)節(jié)蛋白折疊和變性蛋白的重折疊［3，8-9］，調(diào)節(jié)細(xì)胞的脅迫應(yīng)答，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和繁殖［2，6-7，10］.Hernández 等［11］分析了多種細(xì)菌編碼蛋白發(fā)現(xiàn)，原核生物存在含非典型TPR結(jié)構(gòu)域的TPR-DP(TPR followed by asparatate-proline dipeptide repeats domain)結(jié)構(gòu)蛋白，但尚未發(fā)現(xiàn)含有典型TPR結(jié)構(gòu)域的STI1蛋白.

多頭絨泡菌(Physarum polycephalum)是一種介于原核和真核生物之間的過(guò)渡態(tài)真核生物，具有最基本的脅迫應(yīng)答機(jī)能.當(dāng)環(huán)境不利時(shí)，多頭絨泡菌以孢子形式生存;當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，則以原質(zhì)團(tuán)形式繁殖.多頭絨泡菌蛋白質(zhì)大多只具備真核生物蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)和功能，研究多頭絨泡菌STI1蛋白的功能有助于了解生物最基本的脅迫應(yīng)答機(jī)制.本課題組在前期研究中，以多頭絨泡菌14-3-3蛋白 (P14-3-3)為餌蛋白［12］，通過(guò)酵母雙雜交，從多頭絨泡菌cDNA文庫(kù)［13］中分離出一個(gè)由696堿基對(duì) (base pair，bp)組成的STI1類(lèi)似蛋白cDNA片段.本研究通過(guò)5'-端cDNA快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)獲得了該基因的完整cDNA，并檢測(cè)了表達(dá)該蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)對(duì)不同脅迫作用的應(yīng)答反應(yīng);通過(guò)pull-down和質(zhì)譜分析技術(shù)，檢測(cè)了E.coli內(nèi)與PSTI1作用的部分蛋白;初步探索了該蛋白提高原核生物耐受脅迫的能力，確定了該蛋白與脅迫應(yīng)答的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 多頭絨泡菌的培養(yǎng)

參照Daniel等［14］的方法懸浮培養(yǎng)多頭絨泡菌(p.polycephalumPpII(-)strain， ATCC 編 號(hào)24467，德國(guó)雷根斯堡大學(xué)生物物理所 Eggehard Holler教授惠贈(zèng))微原質(zhì)團(tuán).

1.2 PSTI1完整cDNA的分離

取100 mg多頭絨泡菌微原質(zhì)團(tuán) (濕重)，用RNeasy Plant試劑盒 (Qiagen，德國(guó))提取總RNA.用GeneRacerTM試劑盒 (Invitrogen，美國(guó))將含5'-帽子結(jié)構(gòu)的mRNA制備成完整cDNA.根據(jù)PSTI1 3'-cDNA序列設(shè)計(jì)兩條符合GeneRacerTM試劑盒要求的PCR下游引物R1(5'-TATGCGGTGCAGGGCTTG GGACGCTGTT-3')和R2(5'-GGGGTTCCTGG CTCT AATTCCGTCACTT-3').分別組成引物對(duì)①GeneRacerTM5'-引物(5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3')和R1，引物對(duì)②GeneRacerTM5'-套式引物 (5'-G GACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAA-3')和 R2.利用兩組引物從完整cDNA中克隆PSTI1的5'-cDNA，然后用PCR Cleave試劑盒 (Axygen，美國(guó))純化PCR產(chǎn)物，并將PCR獲得片段連接到pMD18-T載體(Takara)，在E.coliTop10(Novagen，美國(guó))中克隆重組質(zhì)粒.通過(guò)Mini-Preps試劑盒 (Takara)提取重組質(zhì)粒，利用引物對(duì)②進(jìn)行PCR鑒定，并測(cè)定插入片段的基因序列.拼接PSTI1的5'-cDNA和3'-cDNA序列獲得PSTI1的完整cDNA序列.

1.3 PSTI1及其功能結(jié)構(gòu)域TPR1和TPR2的重組表達(dá)

以PSTI1完整cDNA為模板，用引物5'-CGG GATCCATGTCAAAAGCAAAACAACAAGCAC-3'(下劃線(xiàn)表示酶切位點(diǎn)BamH I)和5'-ACGCGTCGAC TTACTTTCCAGCGCGTTC-3'(SalI)克隆PSTI1編碼基因.將PCR產(chǎn)物插入載體pET-32a(+)(Novagen，美國(guó))，在E.coliTop10中克隆質(zhì)粒pET-psti1.提取質(zhì)粒 pET-psti1后，轉(zhuǎn)化E.coliOrigamiTM(DE3)，在含50 μg/mL氨芐青霉素和30 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基 (lysogeny broth medium)平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PSTI1(+).

以pET-psti1為模版，用引物對(duì)③(5'-CGGGATC CGGCAACAAATCTTTCGCTG-3'(BamHI)與5'-AC GCGTCGACAGGATCAATTTTAAGGCCA-3'(SalI))和引物對(duì)④ (5'-CGGGATCCAAAAAGGAGGGAAA CGAA-3'(BamH I)與5'-ACGCGTCGACAGGATCA ATTTTAAGGCCA-3'(SalI))分別克隆PSTI1保守肽段TPR1(15～107 aa)和TPR2(135～233 aa)的基因片段tpr1和tpr2，然后重組到載體pET-32a(+)上，制備質(zhì)粒pET-tpr1和 pET-tpr2，并分別轉(zhuǎn)化E.coliOrigamiTM(DE3)，制備轉(zhuǎn)化子TPR1(+)和TPR2(+).通過(guò)Western blot檢測(cè)與硫氧還蛋白 (Thioredoxin，Trx，標(biāo)簽蛋白)融合表達(dá)的Trx-PSTI1、Trx-TPR1和 Trx-TPR2.以含 pET-32a(+)質(zhì)粒、表達(dá) Trx的E.coliOrigamiTM(DE3)轉(zhuǎn)化子PSTI1(-)為對(duì)照.

1.4 免疫印跡

用 LB培養(yǎng)基將 Trx、Trx-PSTI1、Trx-TPR1、Trx-TPR2表達(dá)菌 PSTI1(-)、PSTI1(+)、TPR1(+)和 TPR2(+)培養(yǎng)至光密度值 OD600為0.5～0.6，之后加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)于30℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，以誘導(dǎo)Trx及與Trx融合的PSTI1、TPR1和TPR2表達(dá).取1 mL菌液的菌體進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析，聚丙烯凝膠體積分?jǐn)?shù)為12%.將聚丙烯凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜后，用脫脂奶粉封閉過(guò)夜，用鼠抗Trx標(biāo)簽多抗(Abgent，美國(guó))和堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Proteintech，美國(guó))檢測(cè) Trx、Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2.顯色底物使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍(lán) (bromo-chloro-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium，BCIP/NBT).

1.5 質(zhì)譜檢測(cè)PSTI1 pull-down的大腸桿菌蛋白

取濕重1 g的PSTI1(+)和PSTI1(-)菌體分別與30 mL Tris-HCl緩沖液 (pH=8.0，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl)混合、破碎、取上清，加甘油至終濃度為2.5%(體積分?jǐn)?shù))，加60 μL Ni2+鰲合瓊脂糖凝膠 (Pharmacia公司，美國(guó))，2 h后用Tris-HCl緩沖液洗滌3次，收集凝膠進(jìn)行SDSPAGE分析.

考馬斯亮藍(lán)染色后，切取膠片上存在Trx-PSTI1 pull-down蛋白而不存在Trx pull-down蛋白的蛋白帶;用純水洗膠粒 3次;加 100 μL濃度為 25 mmol/L的NH4HCO3平衡20 min;去液體，加100 μL體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈 (acetonitrile，ACN)溶液(溶于25 mmol NH4HCO3)，脫色2次，30 min/次，至膠粒透明;去液體，加100 μL濃度為25 mmol/L的NH4HCO3平衡20 min;去液體，加100 μL二硫基蘇糖醇 (DL-Dithiothreitol，DTT)溶液 (100 mmol/L DTT、25 mmol/L NH4HCO3)，56℃反應(yīng)60 min;去液體，加100 μL碘乙酞胺 (iodoacetamide，IAA)溶液(55 mmol/L IAA、25 mmol/L NH4HCO3)，暗處反應(yīng)30 min;去液體，加100 μL濃度為25 mmol/L的NH4HCO3溶液平衡20 min;去液體，用乙腈浸泡膠粒2次，40 min/次，去乙腈，干燥10 min;加5 μL質(zhì)量濃度為20 g/mL的質(zhì)譜分析用胰酶 (Trypsin)，4℃酶解30 min;去酶液，加5 μL體積分?jǐn)?shù)為10% 的CAN溶液 (溶于40 mmol/L NH4HCO3)洗膠粒;去液體，再加入5 μL體積分?jǐn)?shù)為10%CAN溶液，37℃水浴10 h.取1 μL多肽提取液與等體積飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸 (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA)溶液混勻;取1 μL樣品點(diǎn)在不銹鋼基質(zhì)輔助激光解吸附電離(matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)靶面上，室溫下干燥;用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF)4800(ABI，美國(guó))檢測(cè)水解肽段，用Mascot搜索引擎的MS/MS Ions模式在NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索質(zhì)譜結(jié)果.

1.6 表達(dá)菌的脅迫培養(yǎng)

從6方面觀(guān)察脅迫培養(yǎng)對(duì) PSTI1、TPR1和TPR2表達(dá)菌PSTI1(+)、TPR1(+)、TPR2(+)生長(zhǎng)的影響，以Trx表達(dá)菌PSTI1(-)為對(duì)照.

鹽和滲透壓脅迫 用LB培養(yǎng)基將PSTI1(+)、TPR1(+)、TPR2(+)和PSTI1(-)培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6，加入終濃度為 1 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)PSTI1、TPR1、TPR2和Trx的表達(dá)，30℃培養(yǎng)4 h后，取菌液3 μL進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑢⒉煌瑵舛鹊木悍謩e滴加到含不同濃度NaCl和山梨醇的培養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)3 d，觀(guān)察菌落生長(zhǎng)差異.

重金屬脅迫 觀(guān)察PSTI1(+)和PSTI1(-)菌落在含有不同濃度CuSO4的LB培養(yǎng)平板上的生長(zhǎng)差異.

氧化脅迫 將不同濃度的H2O2涂布在LB培養(yǎng)板上，20 min后，吸去多余H2O2液，觀(guān)察PSTI1(+)和PSTI1(-)菌落在培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)差異.

缺氧脅迫 取1 mL OD600為0.6的PSTI1(+)和PSTI1(-)菌液，分別加入到100 mL的LB培養(yǎng)液(含1 mmol IPTG)中，其中一組在100 r/min的搖瓶中培養(yǎng)，另一組在200 r/min的搖瓶中培養(yǎng).之后定期取樣測(cè)量PSTI1(+)和PSTI1(-)菌液的OD600值.

酸堿脅迫 用NaOH和HCl調(diào)節(jié)LB培養(yǎng)基至不同pH值，再觀(guān)察PSTI1(+)和PSTI1(-)菌落在不同酸堿度LB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)差異.

溫度脅迫 觀(guān)察PSTI1(+)和PSTI1(-)菌落在不同溫度下的生長(zhǎng)差異.

2 結(jié)果及分析

2.1 PSTI1基因的克隆和表達(dá)

通過(guò)5'-RACE技術(shù)，從多頭絨泡菌完整mRNA中克隆出一段773 bp的cDNA，與PSTI1 3'-cDNA序列拼接，得到一個(gè)996 bp編碼260個(gè)氨基酸的cDNA序列(GenBank編號(hào)為HQ993094).序列比對(duì)結(jié)果如圖1，可見(jiàn)，PSTI1與其他物種STI1同源的序列主要集中在兩個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域上，本研究將這兩個(gè)類(lèi)似的TPR結(jié)構(gòu)域分別命名為T(mén)PR1(15～107 aa，理論相對(duì)分子質(zhì)量10 kDa)和TPR2(135～233 aa，理論相對(duì)分子質(zhì)量11 kDa).比對(duì)結(jié)果顯示，TPR1與TPR2間的連接序列(109～126 aa)比其他物種STI1s對(duì)應(yīng)序列短很多，C-末端序列也比其他STI1s對(duì)應(yīng)序列短，是序列最短的STI1家族成員.

圖1 Blast P2.2.22軟件分析的PSTI1 TPRs所在位置和關(guān)鍵氨基酸位置Fig.1 A sketchmap of TPR domains，TPR motifs and binding sites of PSTI1 predicted using software Blast P2.2.22

Trx的理論相對(duì)分子質(zhì)量為17 kDa，而Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2的理論相對(duì)分子質(zhì)量分別為46、27和28 kDa.通過(guò) Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PSTI1(+)、TPR1(+)、TPR2(+)和 PSTI1(-)表達(dá)產(chǎn)物中與抗Trx抗體結(jié)合的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為46、27、28和17 kDa(圖2的2～5泳道)，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明PSTI1、TPR1和TPR2能在E.coliOrigamiTM(DE3)中與Trx融合表達(dá).

圖2 Western blot檢測(cè)E.coli OrigamiTM(DE3)表達(dá)的Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2Fig.2 Western blot analysis of Trx fusion PSTI1，TPR1 and TPR2 expressed in E.coli OrigamiTM(DE3)

2.2 PSTI1 pull-down的部分大腸桿菌蛋白

圖3 Trx-PSTI1和Trx pull-down蛋白SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Coomassie blue stained SDS-PAGE pattern of Trx-PSTI1 and Trx pull-down proteins

Trx-PSTI1和Trx pull-down的大腸桿菌蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖3.可見(jiàn)，Trx-PSTI1 pulldown的蛋白帶 (泳道2)明顯多于Trx pull-down的蛋白帶 (泳道3)，說(shuō)明大腸桿菌存在與PSTI1作用的蛋白.從泳道2取5條在泳道3未出現(xiàn)的蛋白帶(圖中箭頭所指位置)進(jìn)行質(zhì)譜分析，在帶a(約100 kDa)檢測(cè)到丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase)和二氧酸脫氫酶(2-oxo-acid dehydrogenase);在帶 b(84～89 kDa)檢測(cè)到過(guò)氧化氫酶 Hpii(Catalase Hpii)、由lon基因表達(dá)的La蛋白酶 (lon protease La)、依賴(lài)ATP的蛋白酶 (ATP-dependent proteinase)以及依賴(lài)ATP結(jié)合DNA的La蛋白酶(DNA-binding ATP-dependent protease La);在帶c(64～71 kDa)檢測(cè)到HtpG(Hsp90類(lèi)似蛋白)、D-果糖-6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶 (D-fructose-6-phosphate amidotransferase)和谷氨酸-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(glutamine-fructose-6-phosphate transaminase);在帶d(約57 kDa)檢測(cè)到alkyl-hydro-peroxide reductase(烷甲基還原酶);在蛋白帶e(約23 kDa)檢測(cè)到30S核糖體蛋白 (30S ribosomal protein)亞基S3和S4.

2.3 脅迫作用對(duì)PSTI1表達(dá)菌生長(zhǎng)的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Trx-PSTI1表達(dá)菌PSTI1(+)和Trx表達(dá)菌PSTI1(-)倍比稀釋?zhuān)謩e滴加到含0.5、0.8、1.0 和1.2 mol/L NaCl的 LB 培養(yǎng)板上培養(yǎng) (圖4)，發(fā)現(xiàn)PSTI1(+)比PSTI1(-)生長(zhǎng)效果好，即使在1.2 mol/L NaCl的LB培養(yǎng)板上 PSTI1(+)仍然能夠長(zhǎng)出菌落，說(shuō)明PSTI1能提高E.coli抗鹽脅迫的能力.采用同樣方法檢測(cè)Trx-TPR1表達(dá)菌TPR1(+)和Trx-TPR2表達(dá)菌TPR2(+)耐鹽脅迫的能力 (圖5)，發(fā)現(xiàn)在不同濃度NaCl下生長(zhǎng)的TPR1(+)與 PSTI1(-)沒(méi)有顯著差異;TPR2(+)的生長(zhǎng)能力甚至比PSTI1(-)還差，而PSTI1(+)的生長(zhǎng)能力普遍優(yōu)于TPR1(+)、TPR2(+)和PSTI1(-)，說(shuō)明完整的PSTI1能提高E.coli抗鹽脅迫的能力，但PSTI1的保守肽段TPR1和TPR2則不能提高E.coli抗鹽脅迫的能力.

圖4 PSTI1對(duì)E.coli耐鹽脅迫的影響Fig.4 E.coli expressing Trx fusion PSTI1 are resistance to salt

圖5 PSTI1、TPR1和TPR2對(duì)E.coli耐鹽脅迫的影響Fig.5 E.coli expressing PSTI1，TPR1 and TPR2 are resistant to salt

采用同樣方法，觀(guān)察了PSTI1(+)、TPR1(+)和TPR2(+)在不同濃度山梨醇培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)差異 (圖6)，發(fā)現(xiàn)PSTI1(+)均比PSTI1(-)生長(zhǎng)旺盛，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PSTI1能提高E.coli耐滲透壓脅迫的能力.與 PSTI1(+)相比，TPR1(+)和 TPR2(+)在山梨醇脅迫下的生長(zhǎng)情況顯然不如PSTI1(+)好，但TPR1(+)比PSTI1(-)生長(zhǎng)旺盛，而TPR2(+)與PSTI1(-)相比差異不顯著 (圖7中1.4 mol/L山梨醇脅迫下的菌落)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)TPR1也能提高E.coli耐滲透壓脅迫的能力，但不如完整的PSTI1效果好，而過(guò)表達(dá)TPR2對(duì)E.coli耐滲透壓脅迫的能力沒(méi)有顯著的影響.

圖6 PSTI1對(duì)E.coli耐滲透壓脅迫的影響Fig.6 E.coli expressing Trx-PSTI1 are resistant to osmosis

為確定PSTI1對(duì)E.coli耐重金屬脅迫的影響，觀(guān)察PSTI1(+)和PSTI1(-)在不同濃度CuSO4培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)差異 (圖8)，發(fā)現(xiàn)PSTI1(+)均比PSTI1(-)生長(zhǎng)旺盛，說(shuō)明過(guò)表達(dá) PSTI1能提高E.coli耐Cu2+脅迫的能力.同樣，為確定PSTI1對(duì)E.coli耐氧化脅迫的影響，我們觀(guān)察了PSTI1(+)在不同濃度H2O2培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)差異 (圖9)，發(fā)現(xiàn)PSTI1(+)均比PSTI1(-)生長(zhǎng)旺盛，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PSTI1能提高E.coli耐氧化脅迫的能力.

圖7 PSTI1、TPR1和TPR2對(duì)E.colii耐滲透壓脅迫的影響Fig.7 E.coli expressing PSTI1，TPR1 and TPR2 are resistant to osmosis

圖8 PSTI1對(duì)E.coli耐Cu2+脅迫的影響Fig.8 E.coli expressing PSTI1 are resistant to Cu2+

圖9 PSTI1對(duì)E.coli耐氧化作用脅迫的影響Fig.9 E.coli expressing PSTI1 are resistant to oxidation

為確定PSTI1對(duì)E.coli耐缺氧脅迫的影響，我們測(cè)定了PSTI1(+)和PSTI1(-)在不同搖速下的增殖曲線(xiàn) (圖10).當(dāng)搖速為200 r/min時(shí)，PSTI1(+)與PSTI1(-)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)沒(méi)有顯著差異;當(dāng)搖速為100 r/min時(shí)，PSTI1(+)和PSTI1(-)的增殖速率呈明顯下降，PSTI1(-)增殖速率下降的幅度比PSTI1(+)的增殖速率下降的幅度大，說(shuō)明PSTI1過(guò)表達(dá)能提高E.coli耐缺氧脅迫的能力.

圖10 PSTI1對(duì)E.coli耐缺氧脅迫的影響Fig.10 E.coli expressing PSTI1 are resistant to hypoxia

為確定PSTI1對(duì)E.coli耐受酸堿脅迫的影響，我們觀(guān)察了PSTI1(+)和PSTI1(-)在不同pH培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)差異 (圖11)，發(fā)現(xiàn)pH=5.0和pH=10脅迫條件下PSTI1(+)均比PSTI1(-)生長(zhǎng)旺盛，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PSTI1能在一定程度上提高E.coli耐酸堿脅迫的能力.

為確定PSTI1對(duì)E.coli受溫度脅迫的影響，我們觀(guān)察了PSTI1(+)和PSTI1(-)在不同溫度下的生長(zhǎng)差異 (圖12)，發(fā)現(xiàn)PSTI1(+)在各種溫度下的生長(zhǎng)均不如 PSTI1(-)好，PSTI1(+)和PSTI1(-)菌株在低于28℃下的生長(zhǎng)差異沒(méi)有在高溫下生長(zhǎng)差異的顯著，說(shuō)明PSTI1過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致E.coli對(duì)高溫更敏感.

上述檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，過(guò)表達(dá)PSTI1可以提高大腸桿菌耐受鹽、滲透壓、重金屬離子、氧化作用、缺氧和酸堿變化脅迫的能力，但也會(huì)引起E.coli對(duì)高溫敏感，說(shuō)明PSTI1調(diào)節(jié)E.coli應(yīng)答熱脅迫的機(jī)制與調(diào)節(jié)E.coli應(yīng)答鹽、滲透壓、重金屬離子、氧化作用、缺氧和酸堿變化脅迫的的機(jī)制不同.

圖11 PSTI1對(duì)E.coli耐酸堿變化的影響Fig.11 E.coli expressing PSTI1 are resistant to pH change

圖12 PSTI1表達(dá)引起E.coli對(duì)溫度敏感的變化Fig.12 E.coli expressing PSTI1 are sensitive to temperature

3 討論

人、利什曼原蟲(chóng)、大豆和酵母的STI1分別由543、546、569和589個(gè)氨基酸組成，而PSTI1只有260個(gè)氨基酸，是STI1家族最小的成員.哺乳動(dòng)物STI1含有3個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域 (TPR1、TPR2A和TPR2B)和2個(gè) DP結(jié)構(gòu)域 (DP1和 DP2)［1］，但PSTI1沒(méi)有DP結(jié)構(gòu)域，與其他STI1同源的序列主要集中在兩個(gè)非典型的TPR結(jié)構(gòu)域上，TPR結(jié)構(gòu)域間的連接序列 (18個(gè)氨基酸，酵母STI1的對(duì)應(yīng)序列為250個(gè)氨基酸)和C-末端非TPR序列 (2個(gè)氨基酸，酵母STI1的對(duì)應(yīng)序列為68個(gè)氨基酸)比其他STI1對(duì)應(yīng)序列都短，說(shuō)明PSTI1是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的STI1類(lèi)似蛋白，可能具備STI1蛋白最基本的功能.

現(xiàn)有報(bào)道顯示，STI1蛋白主要通過(guò)其TPR結(jié)構(gòu)域與熱休克蛋白作用［1］，并調(diào)節(jié)熱休克蛋白與其配體蛋白作用［4-7］，以及通過(guò)熱休克蛋白調(diào)節(jié)配體蛋白生物活性［4，6-7］.除 STI1家族成員外，含有典型和非典型TPR結(jié)構(gòu)域的蛋白也具有STI1蛋白類(lèi)似的功能.Brychzy等［15］發(fā)現(xiàn)，含有2個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)DnaJ(E.coli的Hsp40)類(lèi)似結(jié)構(gòu)域的共伴侶蛋白Tpr2不僅通過(guò)TPR結(jié)構(gòu)域識(shí)別Hsp70和Hsp90，還能通過(guò)Hsp70和Hsp90調(diào)節(jié)體內(nèi)的腎上腺皮質(zhì)激素受體 (glucocorticoid receptor，GR)活性.Hernández［11］發(fā)現(xiàn)，原核細(xì)胞存在非典型的TPR結(jié)構(gòu)蛋白，YbbN是在E.coli發(fā)現(xiàn)的與熱脅迫應(yīng)答和DNA合成有關(guān)的共分子伴侶蛋白，其N(xiāo)端存在1個(gè)Trx結(jié)構(gòu)域，C-端存在1個(gè)由4個(gè)非典型TPR序列構(gòu)成的TPR類(lèi)似結(jié)構(gòu)域.Lin等［16］發(fā)現(xiàn)，YbbN能夠溫和地抑制GroESL(GroEL(Hsp60)/GroES(Hsp10))的功能和ATP酶活性，也能顯著提高DnaK(Hsp70)/DnaJ/GrpE(Hsp20)分子伴侶系統(tǒng)的功能，說(shuō)明真核和原核細(xì)胞表達(dá)的典型和非典型TPR結(jié)構(gòu)域蛋白可能都具有STI1蛋白的類(lèi)似功能.

為了解PSTI1及其保守結(jié)構(gòu)域TPR1和TPR2的功能以及對(duì)E.coli脅迫應(yīng)答功能的影響，我們觀(guān)察了表達(dá)PSTI1、TPR1和TPR2的E.coli在脅迫條件下的生長(zhǎng)變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PSTI1可以提高大腸桿菌耐受鹽、滲透壓、重金屬離子、氧化作用、缺氧和酸堿變化脅迫的能力，但會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)高溫敏感，說(shuō)明含有非典型TPR結(jié)構(gòu)域的PSTI1可以廣泛影響大腸桿菌的脅迫應(yīng)答功能.本文還發(fā)現(xiàn)，PSTI1保守肽段TPR1的表達(dá)菌耐受山梨醇脅迫的能力雖然沒(méi)有PSTI1表達(dá)菌強(qiáng)，但比陰性對(duì)照菌強(qiáng)，說(shuō)明TPR1在PSTI1應(yīng)答滲透壓脅迫時(shí)扮演著正調(diào)控的角色.與TPR1表達(dá)菌的耐脅迫作用相反，PSTI1保守肽段TPR2表達(dá)菌在鹽和山梨醇脅迫下的增殖能力顯著低于陰性對(duì)照菌，說(shuō)明TPR2可導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)鹽和滲透壓脅迫敏感，TPR2可能在PSTI1應(yīng)答脅迫作用時(shí)扮演負(fù)調(diào)控的角色.

LIN等［16］通過(guò) pull-down檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，除 GroEL外，與YbbN作用的E.coli蛋白還包括多個(gè)核糖核蛋白亞基.本研究通過(guò)pull-down和質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了與PSTI1作用的部分E.coli蛋白，發(fā)現(xiàn)與PSTI1作用的蛋白包括熱休克蛋白HtpG(Hsp90的類(lèi)似蛋白［17］)，脅迫應(yīng)答蛋白 protease La［18］，具有抗變性、抗氧化功能的catalase Hpii［19-20］等，說(shuō)明PSTI1不僅通過(guò)HtpG等熱休克蛋白參與了E.coli的脅迫應(yīng)答，還可能在調(diào)節(jié)E.coliprotease La和 catalase Hpii的脅迫應(yīng)答功能上扮演著重要角色.此外，PSTI1作用的E.coli蛋白還包括丙酮酸脫氫酶、D-果糖-6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶、氨基葡萄糖，果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)移酶等代謝酶以及30S核糖核蛋白S3和S4，說(shuō)明PSTI1具有E.coli非典型TPR結(jié)構(gòu)蛋白類(lèi)似的功能，是一個(gè)與脅迫應(yīng)答相關(guān)的STPI1類(lèi)似蛋白.

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A novel STI1-like protein fromPhysarum
polycephalumcan enhanceE.coliresponse to stress?

LIU Shi-de，CHEN Han-ying，ZHANG Jian-hua，TIAN Sheng-li，LI Shui-Ming，LI Hui-li，LI Ming-hua，and XING Miao

Shenzhen Key Laboratory of Microbial and Gene Engineering College of Life Sciences Shenzhen University Shenzhen 518060 P.R.China

Stress-inducible protein-1(STI1)family members are conserved from human to yeast，functioning as adaptors to help client proteins to transfer from one heat shock protein to another in response to biologic and abiotic stress.A cDNA encoding 260 amino acids PSTI1 with homologue of STI1 was isolated fromPhysarum polycephalum，termed as PSTI1.This protein contains two atypical TPR domains.To determine the PSTI1 functions in protist response to stress，PSTI1 and its conserved peptides，TPR1 and TPR2，were expressed inE.coliOrigamiTM(DE3).The interacted proteins with PSTI1 were detected and analyzed by pull-down and MALDI-TOF/TOF.The results indicate that theE.coliproteins obtained by PSTI1 pull-down include stress response proteins HtpG(a 90-KDa bacteria Heat shock protein)，catalase Hpii，protease La and metabolic proteins pyruvate dehydrogenase，etc.The growth of the recombinantE.coliunder NaCl，sorbitol，CuSO4，H2O2，hypoxia，acid，alkali and temperature stress showed that PSTI1 expression could enhanceE.coliresistance to the stress except temperature.TPR1 expression could enhanceE.coliresistance to osmosis stress，while TPR2 expression could induceE.colisensitive to salt and osmosis.The results of TPRI expression suggest that PSTI1 is widely involved in cellular response to diversity of stress.Its conserved domains TPR1 and TPR2 may play different roles on PSTI1 functions.

microbiologyandcellbiology;Physarumpolycephalum;STI1-likeprotein;cDNA library;Escherichia coli(E.coli);stress response;fungi;genetic engineering;gene encoding

Q 932;Q 256

A

1000-2618(2011)04-0347-09

2011-01-25;

2011-04-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (30470113)

劉士德 (1962-)，男 (漢族)，吉林省公主嶺市人，深圳大學(xué)副教授、博士.E-mail:liusd@szu.edu.cn

邢 苗 (1954-)，男 (漢族)，深圳大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師.E-mail:xingmiao@szu.edu.cn

Abstract:1000-2618(2011)04-0354-EA

? This work was supported by National Natural Science Foundation of China(30470113).

book=355,ebook=85

【中文責(zé)編:晨 兮;英文責(zé)編:艾 琳】