釀酒酵母表達(dá)基因工程抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性研究

深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司 張 捷 鄭文官 黃 杰 董清風(fēng) 彭永鶴 李永新

抗菌肽在體外可直接殺滅病原微生物，具有廣譜抗菌活性：不僅可以抗革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）、革蘭氏陰性菌（G-）和真菌、原蟲(chóng)等多種病原微生物，還可以抗腫瘤和癌細(xì)胞，甚至可以直接殺滅流感、皰疹等有包膜的病毒，是宿主防御外界病原體入侵的重要分子屏障。目前抗菌肽已在醫(yī)藥、食品防腐、化妝品及動(dòng)物養(yǎng)殖領(lǐng)域等應(yīng)用?；蚬こ炭咕腜a-AMP05為釀酒酵母分泌型表達(dá)，主要存在于發(fā)酵液的上清液中，具有多項(xiàng)免疫功能（王凱等，2009a，b；皮燦輝等，2008）及較高的穩(wěn)定性，且動(dòng)物試驗(yàn)表明，其可以顯著促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康水平（李永新等2009，羅治華等，2009）。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法、微量稀釋法和常量稀釋法，對(duì)其抗菌活性進(jìn)行研究，以此確證基因工程抗菌肽Pa-AMP05的高效抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 基因工程抗菌肽Pa-AMP05發(fā)酵液（抗菌肽含量：500 μg/L）由深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司提供。指示菌大腸桿菌ATCC25922與金黃色葡萄球菌ATCC29213由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因工程抗菌肽Pa-AMP05發(fā)酵過(guò)濾液的制備 吸取10 mL的基因工程抗菌肽Pa-AMP05發(fā)酵液原液分裝到離心管，10000 r/min離心10 min，經(jīng)孔徑為0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，備用。

1.2.2 大腸桿菌和金黃色葡萄球的制備 將大腸桿菌和金黃色葡萄球接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，使其菌數(shù)達(dá)到1×109CFU/mL備用。

1.2.3 瓊脂擴(kuò)散法 參照藥敏試驗(yàn)中瓊脂打孔擴(kuò)散法，把金黃色葡萄球菌和大腸桿菌原菌液濃度調(diào)至1×105CFU/mL，將細(xì)菌均勻涂布到LB培養(yǎng)基上，將滅菌的不銹鋼小管（外徑為5 mm）放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用滅菌針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結(jié)果）。

加樣：1號(hào)和2號(hào)孔分別加入發(fā)酵過(guò)濾液，陽(yáng)性（+）孔加入抗生素(100 μg/mL Zeocin，Invitrogen）、陰性（-）孔加入空載體酵母發(fā)酵過(guò)濾液，各加至滿而不溢為止。

將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)15 h后，觀察抑菌結(jié)果并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 微量稀釋法檢測(cè)抗菌肽抗菌活性

1.2.4.1 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 把已培養(yǎng)好的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌原菌液用LB液體培養(yǎng)基稀釋到 1000倍（1×106CFU/mL）。

在96孔板每個(gè)孔加入空白LB液體培養(yǎng)基100 μL。根據(jù)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)濃度，在第一列加入100 μL 待測(cè)樣品，吸取 100 μL 至第二孔，上下吹打，混合均勻后吸取100 μL至第三孔，第4～8孔操作相同，最后100 μL棄去。這樣每孔對(duì)應(yīng)的體積分?jǐn)?shù)為 1、1/2、1/4、1/8。 第 9孔和第 10孔分別做陽(yáng)性對(duì)照（青霉素鈉）和陰性對(duì)照（滅菌水）?？股兀ㄇ嗝顾剽c200 μg/mL）操作方法同上。最后在每孔中加入100 μL稀釋好的菌液，放入恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.4.2 結(jié)果判斷 以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔（即不含抗菌物質(zhì)）內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報(bào)告結(jié)果，需重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.5 常量稀釋法檢測(cè)抗菌肽抗菌活性 參照藥敏試驗(yàn)中常量肉湯稀釋法，略有改動(dòng)。

1.2.5.1 培養(yǎng)物的制備及培養(yǎng)檢測(cè) 按照不同稀釋比例：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 配置含有發(fā)酵過(guò)濾液的LB液體培養(yǎng)基，分為7個(gè)平行管，其中3管按1%接種量接入大腸桿菌，另3管按1%接種量接入金黃色葡萄球菌，同時(shí)留一管作為對(duì)照管，不接菌種。

以無(wú)菌水與2倍濃度LB培養(yǎng)基按1∶1混合溶液作為陰性對(duì)照，以無(wú)菌水為檢測(cè)OD600值所用參比樣品。將以上所有試管封口后放入37℃的恒溫?fù)u床（250 r/min）里培養(yǎng)12 h，檢測(cè)其OD600值。

1.2.5.2 抗菌活性的檢測(cè) 終OD600值=樣品OD600值-相應(yīng)消除管OD600值。

1.2.5.3 抗菌肽濃度與抗菌活性的線性關(guān)系測(cè)定將檢測(cè)得到的終OD600值與抗菌肽發(fā)酵過(guò)濾液稀釋倍數(shù)做線性回歸分析，根據(jù)R2值判斷二者是否具有線性關(guān)系，以此證明抗菌肽濃度與抗菌活性的線性關(guān)系。

2 數(shù)據(jù)與結(jié)果

2.1 瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好的抑菌效果。其對(duì)金黃色葡萄菌的抑菌圈直徑大小為12 mm，與抗生素陽(yáng)性對(duì)照（100 μg/mL Zeocin）相同。對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小為15 mm，與抗生素陽(yáng)性對(duì)照（100 μg/mL Zeocin）相同。

2.2 微量稀釋法檢測(cè)基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性 通過(guò)微量稀釋法檢測(cè)出抗菌肽及青霉素鈉的MIC值，結(jié)果見(jiàn)表1所示。

表1 微量稀釋法檢測(cè)基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性

結(jié)果測(cè)得青霉素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 值為：3.125 μg/mL， 對(duì)大腸桿菌的 MIC 值為：25 μg/mL。抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌MIC值均為15.625 μg/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC值均為31.25 μg/mL。

2.3 常量稀釋法檢測(cè)基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性 結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，以基因工程抗菌肽發(fā)酵過(guò)濾液的稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，分別以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的OD600值為縱坐標(biāo)，做線性回歸分析，結(jié)果如圖1、2。結(jié)果表明，回歸方程分別為y=0.0206x-0.0952，R2=0.967；y=0.0051x+0.0234，R2=0.9749，即抗菌肽濃度與抗菌活性呈一定的線性正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

目前，瓊脂擴(kuò)散法、微量稀釋法和常量稀釋法為常用的抗菌活性檢測(cè)方法，通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，基因工程抗菌肽Pa-AMP05具有較強(qiáng)的抑制大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為 15.625 μg/mL，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為31.25 μg/mL；同時(shí)檢測(cè)的青霉素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為：3.125 μg/mL， 對(duì)大腸桿菌的 MIC 值為：25 μg/mL。通過(guò)線性回歸分析表明，基因工程抗菌肽Pa-AMP05的濃度與抗金黃色葡萄球菌活性呈一定的線性正相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)中由于抗菌肽Pa-AMP05對(duì)大腸桿菌的MIC值低于對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值，做回歸方程所選取的數(shù)據(jù)，稀釋倍數(shù)最高達(dá)到64倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗菌肽Pa-AMP05對(duì)大腸桿菌的MIC值范圍，導(dǎo)致回歸方程截距為負(fù)值，但是這并不影響其線性關(guān)系的判斷，即抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性強(qiáng)弱可以反映出發(fā)酵液中抗菌肽濃度的高低。此試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，基因工程抗菌肽Pa-AMP05對(duì)所選取的代表性G+、G-具有很好的抑菌活性，具有廣譜的抗細(xì)菌性能。

表2 常量稀釋法檢測(cè)基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性

圖1 基因工程抗菌肽Pa-AMP05濃度與大腸桿菌抗菌活性的線性關(guān)系

圖2 基因工程抗菌肽Pa-AMP05濃度與金黃色葡萄球菌抗菌活性的線性關(guān)系

[1]李永新，王強(qiáng)，周洪波，等.抗菌肽飼料添加劑對(duì)母豬生產(chǎn)性能的影響[J].飼料工業(yè)，2009，30（15）：20 ～21.

[2]羅治華，周洪波，彭永鶴，等.抗菌肽飼料添加劑對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響[J].當(dāng)代畜牧,2009，7：23 ～24.

[3]皮燦輝，王凱，謝燈養(yǎng)，等.抗菌肽制劑對(duì)母豬豬瘟抗體水平的影響[J].養(yǎng)豬，2008，5：11 ～12.

[4]王凱，劉怡武，周洪波，等.抗菌肽飼料添加劑對(duì)豬T淋巴細(xì)胞的影響[J].養(yǎng)豬，2009，3：22.

[5]王凱，羅杰東，周洪波，等.抗菌肽飼料添加劑對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009a，30（5）：52 ～54.