皖北地區(qū)雞致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏實驗

信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校 吳海港

信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 張文建

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 王春梅

雞大腸桿菌病是由致病性血清型的大腸桿菌引起的多種疾病的總稱。在臨床上可表現(xiàn)為臍炎、敗血癥、肉芽腫、全眼球炎、氣囊病、腹膜炎、輸卵管炎等（劉振湘和姚衛(wèi)東，2008）；還常常與病毒和其他細(xì)菌性疾病并發(fā)，造成雞群的高死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，為了解皖北地區(qū)雞肺臟中大腸桿菌的血清型及藥敏性，以便有效地開展預(yù)防和治療工作，本試驗進(jìn)行了雞肺臟大腸桿菌的分離、血清型鑒定及藥敏實驗。

1 材料與方法

1.1 材料 病料于2009年1～9月，從皖北地區(qū)界首、太和、臨泉、亳州等10個縣的42家肉種雞、肉仔雞、蛋種雞、蛋雞場采取；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清由中國獸藥監(jiān)察所提供；試驗用小白鼠由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院提供，體重15～25 g；雛雞購于湖北農(nóng)科院SPF雞場；標(biāo)準(zhǔn)菌株購于中國獸藥監(jiān)察所；藥敏試紙購于杭州藥物研究所。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離鑒定 無菌采取具有敗血癥、心包炎、肝周炎等病理變化的病死雞心血、肝臟、脾臟，分別接種于普通肉湯、普通瓊脂、血液瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，挑選麥康凱瓊脂平板上磚紅色菌落接種普通瓊脂斜面進(jìn)行純培養(yǎng)，培養(yǎng)后膠塞密封，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，同時另挑選單個菌落涂片革蘭氏染色，進(jìn)行菌體形態(tài)和染色特征的觀察。

1.2.2 生化鑒定 取M.C瓊脂平板上粉紅色單菌落接種于普通肉湯，于37℃培養(yǎng)18 h，按常規(guī)方法進(jìn)行糖類發(fā)酵試驗及生化反應(yīng)（陸承平，2007）。

1.2.3 致死性試驗 選取體重15～25 g健康小白鼠和10日齡雛雞各105只，分別隨機分組，每組3只，試驗組小白鼠腹腔接種24 h肉湯培養(yǎng)物0.2 mL/只，試驗組雛雞肌肉注射24 h肉湯培養(yǎng)物0.4 mL/只，對照組分別用同樣方法接種滅菌生理鹽水。觀察發(fā)病和死亡情況、剖檢變化，并進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2.4 血清型鑒定 經(jīng)分離培養(yǎng)、形態(tài)特點和生化試驗鑒定為大腸桿菌后，再用普通瓊脂進(jìn)行純培養(yǎng)（37℃、18 h），然后用少量5 mL/L石炭酸生理鹽水將菌苔洗下，制成濃稠菌懸液，經(jīng)過121℃高壓2 h，破壞其K抗原，冷卻后取一鉑金耳與血清（5～10倍稀釋）在玻板上混勻，如0.5 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，同時以菌懸液與生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象（夏業(yè)才和潘松年，1991）。

1.2.5 藥敏實驗 按藥敏紙片說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 在普通瓊脂平皿板上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起，中等大的菌落，在血液瓊脂平板上長出菌落較大，邊緣整齊，并有隆起的灰白色菌落，多數(shù)不溶血。在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小的磚紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，形成帶有金屬光澤的紫黑色小菌落。在肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后，呈均勻混濁，管底有淡白色黏稠沉淀，管壁液面有菌環(huán)。

2.2 染色鏡檢 病料及培養(yǎng)物涂片染色鏡檢均可見兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生化鑒定結(jié)果 34株致病性大腸桿菌的生化試驗結(jié)果見表1。從表1可以看出各株均能在三糖鐵培養(yǎng)基上產(chǎn)酸產(chǎn)氣使培養(yǎng)基變黃，均不產(chǎn)生H2S。在發(fā)酵葡萄糖、V-P試驗、M-R試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用試驗等常規(guī)生化試驗結(jié)果完全符合大腸桿菌的生化特征，但在某些糖、醇的常規(guī)生化試驗結(jié)果出現(xiàn)了一些差異。

表1 各菌株的生化鑒定結(jié)果

2.4 致死試驗結(jié)果 試驗動物接種后連續(xù)觀察8 d，小白鼠試驗結(jié)果為25株能全部致死小白鼠，4株部分致死，5株不能致死小白鼠。剖檢死亡鼠，心外膜出血，肝腫脹，發(fā)黑或出血。雛雞試驗結(jié)果為23株能全部致死雛雞，5株部分致死，6株不能致死雛雞，剖檢死亡雛雞，表現(xiàn)為纖維素性心包炎、心包積液，肝周炎、肝表面被一層薄膜狀纖維素性滲出物覆蓋，氣囊炎。從死亡小白鼠和雛雞肝臟、腹水、脾臟回收菌的形態(tài)染色，生化特性與接種菌一致。

2.5 血清型鑒定結(jié)果 從10個縣市共分離34株大腸桿菌，除2株未能定性外，共出現(xiàn)10種血清型，結(jié)果見表2。從表2可以看出，從雞肺臟中分離的大腸桿菌以 O2、O78、O26、O22、O1為主， 這 5種血清型合計菌株26株，占定性菌株的80.4%。

表2 32株致病性大腸桿菌的血清型

2.6 藥敏實驗 結(jié)果見表3，分離的大腸桿菌對強力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感，對氧氟沙星、恩諾沙星、新霉素、氨芐青霉素中度敏感，對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸、鏈霉素、紅霉素、土霉素不敏感。

表3 34株大腸桿菌對14種抗生素的藥敏實驗結(jié)果

3 討論

3.1 血清型鑒定 結(jié)果表明，34株雞致病性大腸桿菌的血清型比較復(fù)雜，不同來源的大腸桿菌血清型差異較大，同一來源的菌株O血清型也多不相同。對皖北地區(qū)10個縣市42個雞場中病雞肺臟中分離的大腸桿菌血清型以 O2、O78、O26、O22、O1為主。

3.2 大腸桿菌藥敏試驗 此次分離的大腸桿菌對強力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感，而對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸、鏈霉素、紅霉素、土霉素不敏感。研究表明，大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥性為56.25%，對卡那霉素、新霉素和慶大霉素較敏感（Zhou等，2009；劉吉山等，2000）。鄒玲等（2007）報道，大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥性達(dá)81.8%，而本試驗分離的大腸桿菌對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸的耐藥性較高，可以看出近幾年大腸桿菌對氟喹諾酮的耐藥性有增高趨勢。這種耐藥性的出現(xiàn)可能與菌株長期處于環(huán)境中抗生素的選擇性壓力及耐藥基因通過染色體或耐藥質(zhì)粒在菌群間的廣泛傳播或擴散有關(guān)（Prats等，2000）。最近幾年家禽養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，由于缺乏養(yǎng)殖業(yè)方面的知識，在飼料添加劑及治療中常盲目使用抗菌藥物，導(dǎo)致許多耐藥性菌株產(chǎn)生。大腸桿菌的血清型繁多也是產(chǎn)生耐藥性的原因之一（許蘭菊等，2004），在選擇抗菌藥物上建議考慮采取聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式，一方面可以充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用，增加療效；另一方面可以避免細(xì)菌長期與某一種藥物接觸，減少產(chǎn)生耐藥性幾率。由于大腸桿菌的血清型分布地區(qū)差異比較大，臨床用藥的差異等因素，使得各地區(qū)、各養(yǎng)殖場大腸桿菌的耐藥譜差異很大（刁有祥等，2002）。因此，定期對分離菌株進(jìn)行抗生素敏感性的監(jiān)測，對有效防治養(yǎng)雞場細(xì)菌性疾病有著重要的意義。

[1]刁有祥，李久芹，陳慶普.山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2002，24（1）：21 ～23.

[2]劉吉山，沈志強，李峰.雞大腸桿菌病病原鑒定及藥敏試驗 [J].養(yǎng)禽與禽病防治， 2000，2：190.

[3]劉振湘，姚衛(wèi)東.畜禽傳染病[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008.266～228.

[4]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.98～101.

[5]夏業(yè)才，潘松年.禽大腸桿菌的研究一致病性大腸桿菌血清型鑒定[J].中國獸藥雜志，1991，25（4）：1 ～2.

[6]許蘭菊，張書松，潘學(xué)營.河南省部分地區(qū)雞源致病性大腸桿菌生物特性的研究[J].中國家禽，2004，26（11）：14 ～15.

[7]鄒玲，唐棟，劉文華.雞大腸桿菌病病原的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（2）：119 ～121.

[8]Prats G，Mirelis B，Llovet T.Antibiotic resistance trends in enteropathogenic bacterial isolated in 1985-1987 and 1995-1998 in Barcelona[J].Antimicrob Agents Chemother，2000，44：1140 ～1145.

[9]Zhou Zhi-hui，Gao Bo，Wang Sheng-zhi，et al.Efects of different preservation methods on activity of recombinant E.coli[J].Animal Husbandry and Feed Science，2009，1（6/7）：16 ～18.