凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中4種抗氧化劑

四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心 楊曉鳳

抗氧化劑是確保飼料衛(wèi)生安全的有效途徑之一，可作為飼料抗氧化劑的物質(zhì)很多，如乙氧基喹（EQ）、叔丁基羥基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）和叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）等。1998年11月召開(kāi)的全國(guó)飼料添加劑標(biāo)委會(huì)上規(guī)定：配合飼料中使用抗氧化劑的最高濃度是150 mg/kg（指批準(zhǔn)使用的各種抗氧化劑的濃度總和），超量添加抗氧化劑受到限制（李侯根，2000）。因此，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法。

近年來(lái)，對(duì)抗氧化劑的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（穆同娜等，2007；李興根和韓芷玲，2006）、液相色譜法（胡小鐘等，2000）和氣相色譜-質(zhì)譜法（郭嵐等，2007；岳振峰等，2004），但同時(shí)測(cè)定BHA、BHT、TBHQ和EQ 4種抗氧化劑的報(bào)道較少。本研究旨在建立用氣相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中4種抗氧化劑的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 美國(guó)Agilent 7890A氣相色譜儀，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、FID檢測(cè)器；美國(guó)J2 Scientific凝膠滲透色譜儀，配有Biobeads S-X3玻璃柱（型號(hào)：CO785，22 g，19 cm×2 cm）； 瑞士 Büchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

丙酮（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）、環(huán)己烷（分析純）。

標(biāo)準(zhǔn)品：BHA、BHT、TBHQ和EQ均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：（1）BHA、BHT、TBHQ： 準(zhǔn)確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，分別置于50 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，此儲(chǔ)備液濃度為1.0 mg/mL。臨用時(shí)，根據(jù)需要，用丙酮稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。（2）EQ：準(zhǔn)確稱(chēng)取250 mg，置于50 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，此儲(chǔ)備液濃度為5.0 mg/mL。臨用時(shí)，根據(jù)需要，用丙酮稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2 色譜分析條件 色譜柱為Rxi-17石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氮?dú)猓兌?≥ 99.999%）；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣（分流比=10∶1）；恒流模式：氮?dú)饬魉贋?2.0 mL/min；氫氣流速：30 mL/min，空氣流速：400 mL/min；進(jìn)樣口溫度：230℃，檢測(cè)器溫度：300℃，柱溫采用程序升溫：始溫100℃，以15℃/min升到240℃，保持2 min。在此條件下的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（標(biāo)樣濃度為100 mg/L）及加標(biāo)回收樣品色譜圖（添加水平為100 mg/kg）見(jiàn)圖 1。

1.3 樣品檢測(cè)步驟

1.3.1 溶劑篩選及提取方法 選擇乙睛、甲醇、正己烷、丙酮、二氯甲烷5種提取劑，比較提法，效果及回收率。提取方法為：稱(chēng)取2 g（精確至0.001 g）飼料于50 mL離心管中，加人15 mL提取劑，用高速均質(zhì)器以10000 r/min提取2 min，再以4000 r/min離心3 min，傾出上清液于100 mL雞心瓶中，重復(fù)提取一次，合并提取液，于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用10.0 mL乙酸乙酯+環(huán)己烷（1+1）溶解殘?jiān)^(guò)0.45 μm濾膜，供凝膠凈化。

1.3.2 GPC凈化 試驗(yàn)選擇了500 mg/L的混合標(biāo)樣直接過(guò)凝膠滲透色譜柱（Biobeads S-X3），采用體積比為1:1的乙酸乙酯-環(huán)己烷作為流動(dòng)相，進(jìn)樣量為5 mL，流速為4.7 mL/min，從8 min起每1 min收集一份樣品，共收集8份樣品溶液，分別用氣相色譜檢測(cè)各段流出液中BHA、BHT、TBHQ和EQ的含量。收集9～13 min流出的組分于旋蒸瓶中，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用丙酮定容至5.0 mL，溶液過(guò)0.45 μm濾膜，供氣相色譜測(cè)定。

1.3.3 4種抗氧化劑的線性關(guān)系與檢出限 用氣相色譜（GC）分析法檢測(cè)四種抗氧劑在不同濃度下（10、20、50、100、200、300、400 mg/L）的濃度 C與峰面積A進(jìn)行相關(guān)性分析，同時(shí)確定各氧化劑的檢出限。

1.3.4 準(zhǔn)確度與精密度評(píng)價(jià),在魚(yú)粉樣品中分別添加一定量的混合抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加濃度分別為50、100、200 mg/kg，按上述所選擇的最優(yōu)條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，得出4種抗氧化劑的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇 5種提取溶劑提取結(jié)果如下：其中，二氯甲烷提取的雜質(zhì)較多，顏色最深，且由于二氯甲烷的密度較大，樣品離心時(shí)難以分層；甲醇提取的顏色次之，不利于凈化；正己烷提取的回收率不能滿足要求；而乙腈和丙酮的回收率都能滿足要求，但丙酮提取液的顏色較乙腈提取液的顏色深，故也不被采用；乙腈極性大，穿透力強(qiáng)，且乙腈作為提取溶劑時(shí)很多親脂性化合物如脂肪等較少地被萃取出來(lái)，更便于凈化，因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為提取劑。

2.2 凝膠滲透色譜凈化結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第9分鐘的流出液中開(kāi)始檢出BHT、BHA、TBHQ，第10分鐘開(kāi)始檢出EQ，第11 min 4種抗氧化劑均被檢出，第12分鐘未檢出BHT、BHA、TBHQ，只檢出EQ，第13分鐘也只檢出微量 EQ；第14分鐘未檢出抗氧化劑。因此，選擇留出時(shí)間為9～13 min作為4種抗氧化劑的收集時(shí)間（即收集第42～66 mL的流出液）。同時(shí)，對(duì)于飼料樣品而言，油脂和絕大部分色素在9 min前被去除掉，說(shuō)明本凈化方法達(dá)到了將目標(biāo)化合物和干擾雜質(zhì)分離的效果。

2.3 方法的線性關(guān)系和檢出限 表1是4種抗氧化劑在不同濃度（10、20、50、100、200、300、400 mg/L）水平下進(jìn)行色譜分析得到的濃度（C）與峰面積（A）的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。從表1可以看出，在所測(cè)定的范圍內(nèi)，4種抗氧化劑峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，能準(zhǔn)確定量。

表1 4種抗氧化劑的保留時(shí)間、線性方程和檢出限

2.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度 結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，BHT、BHA、EQ在三種不同濃度時(shí)的回收率均大于95%（除BHA 50 mg/kg為94.7%以外），TBHQ均大于80%且4種抗氧化RSD值均小于5%。因此該法具有較好的準(zhǔn)確性和精密度，適合飼料樣品中抗氧化劑的測(cè)定。

表2 方法的回收率及精密度 %

3 結(jié)論

GPC-GC能夠去除樣品中脂肪和色素等大分子雜質(zhì)，操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，自動(dòng)化程度高，能夠滿足大量樣品的快速檢測(cè)要求，可很好地用于飼料中抗氧化劑的測(cè)定。

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