產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離與篩選

河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 韓雪

河北省獸藥監(jiān)察所 李研東

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 王 穎

乳酸菌是一種在食品發(fā)酵工業(yè)和微生態(tài)制劑中廣泛應(yīng)用的益生菌。它可以抑制或殺死一些病原菌和腐敗菌，有利于人和動(dòng)物的健康。細(xì)菌素是乳酸菌發(fā)揮益生作用的主要物質(zhì)。因其具有高效、無毒、無殘留、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，已成為抗生素有效的替代物（周志江等，2006）。本試驗(yàn)旨在篩選產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌菌株，為細(xì)菌素聯(lián)合物或細(xì)菌素與其他抗菌劑聯(lián)合使用創(chuàng)造條件，彌補(bǔ)使用單一細(xì)菌素的缺陷和不足。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 乳酸菌來源 君樂寶酸奶、完達(dá)山老酸奶、槐茂醬菜、靈生阿里郎韓國泡菜（市售）；10份東北發(fā)酵酸白菜（自制）。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌為河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院保留菌種。

1.1.3 TGE培養(yǎng)基 蒸餾水 1000 mL、pH值為6.5、蛋白胨 10.00 g、酵母浸提物 4.00 g、牛肉膏6.00 g、葡萄糖10.00 g、硫酸錳0.05 g、硫酸鎂0.10 g、吐溫 80 0.2%，0.08 Mpa滅菌 30 min（韓雪和周志江，2006）。

1.2 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的分離 沾取原料液于TGE固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃靜置培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取單菌落接種于TGE液體培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液10000 r/min離心15 min，取上清，用軟瓊脂擴(kuò)散法驗(yàn)證發(fā)酵上清液的抑菌效果。

平板底層平鋪薄薄一層固體TGE培養(yǎng)基，再將10 mL含有l(wèi)06CFU大腸桿菌/枯草芽孢桿菌的軟瓊脂平鋪在固體TGE上，用打孔器在鋪好培養(yǎng)基的平板上打直徑為5 mm的孔，取發(fā)酵上清100 μL加入到孔中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，檢查平板上形成的抑菌圈。

1.3 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的鑒定 挑選形成抑菌圈的菌株做革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)和染色特征，進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)、耐熱試驗(yàn)。厭氧或兼性厭氧的G+無芽孢菌，過氧化氫酶陰性，初步認(rèn)定為乳酸菌。

1.4 抑菌物質(zhì)為乳酸菌細(xì)菌素的初步確定

1.4.1 酸抑菌作用排除 為了排除乳酸菌代謝產(chǎn)物中有機(jī)酸對(duì)抑菌效果的影響，將5株乳酸菌發(fā)酵液上清液的pH調(diào)至中性后再進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。乳酸菌發(fā)酵液10000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)其pH值，用l mol/L NaOH和l mol/L HCl將上清液調(diào)至pH值6.0，以大腸桿菌為指示菌，pH 6.0的乳酸溶液為對(duì)照，用軟瓊脂擴(kuò)散法驗(yàn)證中性上清液的抑菌效果。

1.4.2 過氧化氫抑菌作用排除 為排除過氧化氫對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌作用的影響，將5株乳酸菌發(fā)酵上清液用過氧化氫酶處理，未經(jīng)處理的發(fā)酵上清為對(duì)照，大腸桿菌為指示菌，用軟瓊脂擴(kuò)散法驗(yàn)證上清液的抑菌效果。

1.5 細(xì)菌素性質(zhì)初步確定 采用軟瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)酶、溫度、有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)菌素抗菌活性的影響。為檢測(cè)不同酶對(duì)細(xì)菌素抗菌活性的影響，將發(fā)酵上清液調(diào)到pH 7.0，加胰蛋白酶、蛋白酶K、α-胰凝乳酶、胃蛋白酶、DNA酶、脂肪酶和過氧化氫酶至終濃度0.5 mg/mL，37℃作用1 h，然后測(cè)定抑菌活性。

將發(fā)酵上清液分別置 60、80、100、121 ℃處理15 min，檢測(cè)細(xì)菌素對(duì)熱的耐受力。

將發(fā)酵上清液按1∶2的比例分別加入甲醛、乙醇、丙酮，室溫下處理2 h后，對(duì)混合液進(jìn)行真空蒸餾處理以除掉有機(jī)溶劑。檢測(cè)細(xì)菌素對(duì)有機(jī)溶劑的耐受力。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離 對(duì)4份市售乳酸菌來源材料和10份自制酸白菜樣品進(jìn)行了試驗(yàn)，每個(gè)樣品劃線培養(yǎng)至長出明顯的單菌落，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)后取上清液做抑菌試驗(yàn)。本試驗(yàn)分別從槐茂醬菜（L1）、靈生韓國泡菜（L2）、完達(dá)山老酸奶（L3）中各分離出一株、從東北酸白菜中分離出兩株（L4、L5）具有抑菌活性（同時(shí)抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌）的菌株。

2.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定 對(duì)分離出有抑菌活性的菌株做形態(tài)學(xué)和生化試驗(yàn)。5個(gè)菌株的菌落形態(tài)均為圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑、乳白色、不透明的光滑型菌落，革蘭氏染色陽性菌，不運(yùn)動(dòng)、無芽孢。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，5個(gè)菌株均為厭氧或兼性厭氧，過氧化氫酶陰性。初步確定該5株菌為乳酸菌。

2.3 細(xì)菌素抑菌干擾因素排除

2.3.1 排除有機(jī)酸的影響 將發(fā)酵上清液pH調(diào)至6.0后，與對(duì)照組比，對(duì)照pH 6.0對(duì)指示菌已經(jīng)沒有作用，而pH 6.0的發(fā)酵上清液對(duì)指示菌仍有抑制作用，可見排除pH干擾后，發(fā)酵液中還存在其他抑菌活性物質(zhì)。

2.3.2 排除過氧化氫的影響 L1～L5菌株的濃縮上清液經(jīng)過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑和濃縮上清原液的抑菌圈直徑相比變化不大（見表1），從而可以證明菌株和發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)不完全是過氧化氫，還有另外的抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌有抑制作用。

表1 排除過氧化氫影響抑菌結(jié)果 mm

2.4 抑菌物質(zhì)性質(zhì)初步確定 試驗(yàn)結(jié)果顯示：加蛋白酶K和胰蛋白酶后抑菌物質(zhì)的活性消失，而加入過氧化氫酶、脂肪酶和DNA酶不能使其失活（見表 2）。 將提取物溶液分別置 60、80、100、121℃處理15 min后，抑菌物質(zhì)仍保持活性（見表3）。有機(jī)溶劑甲醛、乙醇、丙酮均不影響抑菌物質(zhì)的抑菌活性（見表4）。

表2 抑菌物質(zhì)對(duì)酶的敏感性

表3 抑菌物質(zhì)對(duì)溫度的敏感性

表4 抑菌物質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑的敏感性

3 結(jié)論

乳酸菌種類繁多，被廣泛應(yīng)用于乳制品、發(fā)酵植物食品如泡菜、酸菜和青貯飼料等。其產(chǎn)生的乳酸菌素亦被廣泛用于食品、飼料的保鮮防腐等方面（Fernandez等，2004）。本試驗(yàn)通過對(duì)不同來源材料中乳酸菌的分離鑒定，初步篩選出五株對(duì)大腸桿菌（G-）和枯草芽孢桿菌（G+）均具有較強(qiáng)抑制作用的菌株。該5株乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸菌素對(duì)非蛋白酶類、溫度和有機(jī)溶劑均不敏感，表現(xiàn)出了良好的理化性質(zhì)。本試驗(yàn)將進(jìn)一步研究5株乳酸菌的生物學(xué)特性、安全性、抑菌范圍、抑菌物質(zhì)產(chǎn)量，為其在食品保鮮防腐方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

[1]韓雪，周志江.乳酸片球菌細(xì)菌素的活性及特性的研究[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（4）：19 ～21.

[2]周志江，韓燁，韓雪，等.從酸白菜中分離出一株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸片球菌[J].食品科學(xué)，2006，27（4）：89 ～92.

[3]Fernandez A，Horn N，Gasson M J，et al.Rodriguez J M.High-level coproduction of the bacteriocins nisin A and lactococcin A by Lactococcus lactis[J].Journal of Dairy Research，2004，71：216 ～221.