羅布麻種子老化過程中的生理生化特性

張永娟,韓 蕊,原 燁,梁 虹,馮子蓉,戎郁萍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，北京 100193)

羅布麻(Apocynumvenetum)是夾竹桃科羅布麻屬中具有重要生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多年生草本植物[1]，耐旱、耐寒、耐鹽堿、耐風(fēng)沙，生長在山溝、岸邊、干旱沙漠或內(nèi)陸盆地、海濱鹽堿低濕地[2]。羅布麻可在極端惡劣的環(huán)境下生存，在最低溫度-47 ℃的新疆北部阿勒泰地區(qū)能夠安全越冬；在我國最熱地區(qū)吐魯番盆地夏天溫度達(dá)47 ℃時(shí)依舊生長良好[3]。近年來，關(guān)于羅布麻的研究大多集中在抗鹽、醫(yī)藥應(yīng)用、纖維紡織利用等領(lǐng)域[4-5]，關(guān)于羅布麻種子的適應(yīng)性及劣變規(guī)律的研究較少。

種子是蘊(yùn)藏著生命力的植物器官，它和一切活的有機(jī)體一樣，同外界環(huán)境構(gòu)成不可分割的統(tǒng)一整體[6]。種子活力水平主要受遺傳因子和外界因素的制約[7]。環(huán)境對(duì)種子劣變影響很大。在自然老化條件下，種子內(nèi)部發(fā)生一系列的生理生化變化，生理變化表現(xiàn)為種子萌發(fā)緩慢，萌芽力下降，耐逆境能力減弱；生化方面表現(xiàn)為超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性、貯藏性物質(zhì)、合成能力、呼吸作用、有毒物質(zhì)含量和遺傳物質(zhì)變異等多方面的變化[6]。種子在普通貯藏條件下老化非常緩慢，很難在較短的時(shí)間內(nèi)測(cè)定種子活力。加速老化能夠克服這個(gè)缺點(diǎn)，使種子活力差別在較短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出來[8]。在人為控制條件下，將種子短期內(nèi)放在高溫和高濕環(huán)境中，從潮濕的環(huán)境中吸水，可提高種子含水量，伴隨高溫導(dǎo)致種子迅速老化[9]。老化不僅影響種子萌發(fā)及幼苗生長，也影響后期植株的品質(zhì)和產(chǎn)量[10]。目前，國內(nèi)外關(guān)于種子老化及劣變機(jī)理的報(bào)道很多。老化在茄子(Capsicoidesallioni)、黃瓜(Cucumissativus)、辣椒(Capsicumannuum)等蔬菜種子中研究已較普遍[11-13]。糧食作物方面，覃鵬等[14]、劉明久等[15]分別研究了人工老化對(duì)小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)生理生化特性的影響。在牧草種子研究中也已開展了相關(guān)研究[16-18]。但不同植物種子對(duì)老化要求的條件不同，生理生化特性的表現(xiàn)也不盡相同，因此需要進(jìn)一步研究不同植物在老化條件下的生理生化特性的變化規(guī)律。

本研究以羅布麻種子為試驗(yàn)材料，采用人工加速老化法，對(duì)其老化過程中的生理生化特性變化規(guī)律進(jìn)行初步研究，探討老化條件下種子活力的劣變規(guī)律，分析其在自然生態(tài)環(huán)境中活力喪失的機(jī)制，對(duì)合理貯藏種子，以保持或提高種子活力提供理論依據(jù)，也對(duì)羅布麻資源的開發(fā)利用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 2009年采集于新疆巴州地區(qū)尉犁縣的羅布紅麻種子。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1人工加速老化處理 老化方法參照王玉紅等[19]的方法加以調(diào)整。選取潔凈種子鋪于裝有蒸餾水的老化盒內(nèi)干燥篩網(wǎng)上，水面距種子約1 cm。放入設(shè)定溫度的老化箱內(nèi)。老化箱上放置一水源，確保老化期間濕度為100%。老化溫度設(shè)定為35、50 ℃，分別進(jìn)行12、24、36、60和84 h的人工老化處理，以未經(jīng)加速老化處理的種子為對(duì)照，分期取出老化種子，攤晾使其恢復(fù)至原質(zhì)量后進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2電導(dǎo)率測(cè)定 參照徐本美和韓建國[20]方法，稱取處理后種子0.1 g，重復(fù)4次，先用清水沖洗3次，再用去離子水沖洗2次，將種子表面的浮水用濾紙擦干，放入100 mL三角瓶中，同時(shí)設(shè)一對(duì)照，加入30 mL去離子水，用錫箔紙封口后在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h，用DDS-Ⅱ型電導(dǎo)儀測(cè)定浸出液的電導(dǎo)率。

1.2.3脫氫酶活性測(cè)定 參考陶梅和辛萍萍[21]的方法，稱取各處理種子0.1 g，4次重復(fù)，浸泡于蒸餾水中在20 ℃條件下放置24 h，用濾紙吸干浮水，小心剝除種皮，用0.1%TTC在38 ℃恒溫條件下黑暗染色3 h，達(dá)到反應(yīng)時(shí)間后倒出TTC溶液，用蒸餾水將種子洗凈，用濾紙吸干表面浮水，將染色的胚放入具塞試管內(nèi)，加入95%酒精10 mL，然后在35 ℃恒溫箱中提取24 h，達(dá)規(guī)定時(shí)間后提取液于490 nm處以95%酒精做空白測(cè)吸光度值，以光密度OD值的大小表示脫氫酶活性的高低。

1.2.4POD活性測(cè)定 參照李玲[22]方法。酶粗提液提?。悍Q取種子0.2 g，3次重復(fù)，加入6 mL 50 mmol/L的pH值7.8的磷酸緩沖液，于研缽中研磨成勻漿，4 000 r/min離心15 min，收集上清液低溫保存。

活性測(cè)定：比色杯中加入3 mL反應(yīng)液和1 mL磷酸緩沖液作為對(duì)照，間隔2 min讀值。POD活性[U/(g·min)]=(ΔA470·VT)/(W·VS·0.01×t)。ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光值變化；W為種子質(zhì)量(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；VT為提取酶液總體積(mL)；VS為測(cè)定時(shí)取用的酶液體積(mL)。

1.2.5浸出液可溶性糖含量測(cè)定 參照黃學(xué)林和陳潤政[23]的方法，稱取0.1 g處理種子，3次重復(fù)，將種子放在20 ℃條件下用100 mL蒸餾水浸泡24 h，然后吸取浸提液1 mL，放入干凈的試管中，各加入5 mL蒽酮試劑，小心振蕩使其混合均勻。在沸水浴中保溫10 min冷卻，以對(duì)照調(diào)零在620 nm波長測(cè)定光密度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求可溶性糖的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取0.1 g無水葡萄糖溶先用蒸餾水定容至1 000 mL，此為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液。由母液配制成的每毫升含葡萄糖0、20、40、60、80、100 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，再加入5 mL蒽酮試劑(0.2 g蒽酮溶于100 mL 76%稀硫酸中)充分混合均勻，放入100 ℃水浴鍋中加熱10 min，自然冷卻后，以空白為對(duì)照，在620 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1老化處理對(duì)羅布麻種子浸出液電導(dǎo)率的影響 隨著老化溫度的提高和老化時(shí)間的延長，羅布麻種子的電導(dǎo)率在初期平緩下降后逐漸上升，并在老化后84 h達(dá)到最高值。在相同老化溫度下，隨著老化時(shí)間的延長，電導(dǎo)率急劇上升(圖1)。

圖1 人工加速老化處理對(duì)種子電導(dǎo)率的影響

在老化初期12和24 h羅布麻種子的電導(dǎo)率與對(duì)照相比均出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1)，且35 ℃與50 ℃老化處理電導(dǎo)率基本持平，都與對(duì)照之間差異不顯著(P>0.05)。盡管36 h老化處理后種子電導(dǎo)率增加，但與對(duì)照相比差異不顯著。從老化處理60 h后，種子電導(dǎo)率比對(duì)照顯著提高(P<0.05)。50 ℃老化條件下的電導(dǎo)率增幅高于35 ℃，50 ℃老化處理60、84 h的電導(dǎo)率比35 ℃老化處理的電導(dǎo)率分別高7.64%和16.09%。說明隨著種子老化程度的加劇，膜系統(tǒng)受到破壞，且溫度越高破壞性越大，細(xì)胞內(nèi)的礦物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率升高。

2.2老化處理對(duì)羅布麻種子脫氫酶活性的影響 隨著老化時(shí)間的延長，脫氫酶活性均呈下降趨勢(shì)(圖2)。35 ℃老化條件下下降趨勢(shì)較為平緩，50 ℃在老化初期就急劇下降。在各處理時(shí)期35 ℃老化條件下脫氫酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于50 ℃，50 ℃老化條件下在處理36 h以后脫氫酶活性變?yōu)?。各處理與對(duì)照相比均差異顯著(P<0.05)。脫氫酶在種子萌發(fā)過程中起非常重要的作用，其活性的下降反映了種子萌發(fā)能力的下降[24]。說明，脫氫酶活性對(duì)老化處理反應(yīng)比較敏感，溫度越高對(duì)脫氫酶活性影響越大，在高溫老化條件下短期內(nèi)即可失活。

圖2 人工加速老化處理對(duì)種子脫氫酶活性的影響

2.3老化處理對(duì)羅布麻種子過氧化物酶活性的影響 POD活性均隨著老化時(shí)間的延長而逐漸下降(圖3)，老化初期(0～12 h)，POD活性迅速降低，老化后期下降速度趨于平緩。不同處理之間POD活性下降趨勢(shì)有所不同，在整個(gè)處理期間POD活性50 ℃明顯高于35 ℃。其中，在50 ℃老化條件下，處理12 h后隨處理時(shí)間延長呈微升趨勢(shì)，但是各處理(12、24、36、60、80 h)之間差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于對(duì)照(P<0.05)。35 ℃老化條件下，各處理均顯著低于對(duì)照，處理12 h顯著高于其他處理，24、36、60、80 h處理之間差異不顯著。結(jié)果表明，羅布麻種子POD活性在老化初期都會(huì)有不同程度地下降，隨后變化趨勢(shì)趨于平穩(wěn)。POD是清除活性氧的抗氧化酶之一，POD 活性的下降使種子中超氧化物陰離子自由基的含量積累增加，加大了對(duì)種子的毒害作用。

圖3 人工加速老化處理對(duì)種子過氧化物酶活性的影響

2.4老化處理對(duì)羅布麻種子浸出液可溶性糖含量的影響 在高溫高濕老化過程中，相同溫度下羅布麻種子浸出液中可溶性糖含量隨著老化時(shí)間的延長逐漸增加；相同老化時(shí)間下，溫度越高，浸出液可溶性糖含量上升趨勢(shì)越大(圖4)。在整個(gè)處理過程中50 ℃處理種子可溶性糖含量一直高于35 ℃處理種子，84 h時(shí)都達(dá)到最大值，分別為82.97和65.63 μg/mL。

老化初期(0～24 h)可溶性糖含量上升比較緩慢。隨著老化的進(jìn)行，在35 ℃條件下，24～36 h階段可溶性糖含量增速明顯加快；在50 ℃條件下，24～36和60～84 h階段可溶性糖增速明顯加快(圖4)。除12 h處理與對(duì)照相比差異不顯著外，其他各處理與對(duì)照相比差異均顯著(P<0.05)。說明，種子可溶性糖含量均在老化24 h后顯著增加，與電導(dǎo)率變化有相似特征，可能是由于在老化初期種子經(jīng)過短暫自我修復(fù)，膜的傷害程度相對(duì)較小，可溶性糖作為電導(dǎo)率浸出液的成分之一，影響較小。在處理后期，質(zhì)膜的透性增大，種子受傷害的程度增加，可溶性糖量損失增加。

圖4 老化處理對(duì)種子可溶性糖含量的影響

3 討論

植物細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)具有選擇通透性。質(zhì)膜是植物在逆境脅迫中首先受到傷害的原初位點(diǎn)[25]。植物組織受到傷害，膜的結(jié)構(gòu)受損，膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)各種水溶性物質(zhì)將外滲，此時(shí)將植物組織浸入去離子水中，水的電導(dǎo)率將因電解質(zhì)的外滲而加大。傷害愈重，外滲愈多，電導(dǎo)率的增加也愈大，故可通過測(cè)定外液電導(dǎo)率增加值得知膜傷害程度[26]。近年來關(guān)于質(zhì)膜受損這一植物生理指標(biāo)在種子老化裂變期間的研究越來越多[27-28]。40 ℃加速老化處理下，2種小麥種子的電導(dǎo)率隨著老化處理時(shí)間的延長先降后升，因此,在輕度老化條件下植物抗逆性增加，減小了細(xì)胞膜的受損程度[26]。穆瑞霞[29]在人工老化與引發(fā)對(duì)大蔥(Alliumfistulosum)種子活力及幼苗生理生化變化的影響中發(fā)現(xiàn),種子浸出液的電導(dǎo)率在出現(xiàn)短暫下降后升高，認(rèn)為隨著老化的進(jìn)行膜系統(tǒng)經(jīng)過短暫的自我修復(fù)，電導(dǎo)率下降，之后由于高溫高濕老化程度的加重，膜系統(tǒng)受損嚴(yán)重電導(dǎo)率升高。然而在老化過程中，不同材料的電導(dǎo)率并不都是先降低后升高的。李玉榮等[17]在人工加速老化藍(lán)莖冰草(Agropyronsmithii)種子中發(fā)現(xiàn),電導(dǎo)率隨老化時(shí)間的延長逐漸降低，這可能是由種子組成導(dǎo)致的。在牧草種子中，羊草(Leymuschinensis)、新麥草(Psathyrostachysjuncea)、高羊茅(Festucaelata)、紫花苜蓿(Medicagosativa)老化研究中種子電導(dǎo)率則隨老化的進(jìn)行一直上升[30-33]。本研究得出電導(dǎo)率隨著老化時(shí)間的延長在老化初期下降緩慢，這可能是由于羅布麻種子本身耐熱性較強(qiáng)在初期高溫環(huán)境中抗逆機(jī)制導(dǎo)致電導(dǎo)率降低；而后逐漸增大，且老化條件越高對(duì)種子傷害程度越大，膜的透性增大造成與代謝有關(guān)的各種物質(zhì)外滲，電導(dǎo)率可以反映種子劣變情況，可以作為測(cè)定羅布麻種子老化生理指標(biāo)之一。

脫氫酶是測(cè)定種子生活力的重要指標(biāo)之一，在呼吸過程中起重要作用，其可以快速地體現(xiàn)種子胚的還原能力。在本研究中，50 ℃老化處理比在35 ℃老化處理下脫氫酶活性喪失速度快且在36 h以后活力就消失，而35 ℃脫氫酶活性下降比較緩慢，表明在高溫老化進(jìn)程中羅布麻種子脫氫酶活性下降速率明顯大于低溫老化的種子。50 ℃老化條件對(duì)羅布麻種子活性影響較大。

植物遭受滲透脅迫時(shí)，細(xì)胞中生物活性氧的積累是造成細(xì)胞傷害乃至死亡的主要原因，而細(xì)胞中清除活性氧的保護(hù)酶系統(tǒng)的存在和活性增強(qiáng)，是細(xì)胞免于傷害或抗性增強(qiáng)的主要原因之一[34]。過氧化物酶是細(xì)胞內(nèi)活性氧清除劑之一，和超氧化物歧化酶、過氧化氫酶統(tǒng)稱為細(xì)胞保護(hù)酶。一般認(rèn)為人工老化會(huì)影響細(xì)胞酶活性的變化，進(jìn)而影響種子內(nèi)部的代謝過程，酶活性降低，清除過氧化物和自由基的能力逐漸降低，細(xì)胞損害加大[35]。通常情況下過氧化物酶活性會(huì)隨著老化的進(jìn)行逐漸減低，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)的破壞隨老化時(shí)間的延長逐漸加劇。在本研究中種子過氧化物酶在不同的老化溫度下初期都有下降趨勢(shì)，這對(duì)于有毒物質(zhì)活性氧、自由基等的清除非常不利。本研究結(jié)果顯示在高溫高濕下過氧化物酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于低溫高濕老化環(huán)境下的活性，且在高溫(50 ℃)老化處理12 h后有微升趨勢(shì)。這可能是種子長時(shí)間處于高溫環(huán)境中為抵御50 ℃高溫的傷害，通過提高自身過氧化物酶的活性來降低傷害，這是對(duì)高溫老化作出主動(dòng)適應(yīng)。說明羅布麻種子耐熱較強(qiáng)，能夠?qū)Ω邷丨h(huán)境作出抗逆反應(yīng)，羅布麻抵抗高溫及老化的能力強(qiáng)。

糖是植物組織含量最多的有機(jī)化合物，是生命活動(dòng)的主要能量來源和細(xì)胞的重要物質(zhì)，可溶性糖是種子萌發(fā)至開始進(jìn)行光合作用前的呼吸底物。細(xì)胞內(nèi)糖分的損失會(huì)對(duì)細(xì)胞正常的生理生化活動(dòng)造成影響[30]。Kalpana和Madhava[36]在木豆(Cajanuscajan)栽培品種種子加速老化過程中脂類的變化中發(fā)現(xiàn)，隨種子劣變的發(fā)生，引起膜結(jié)構(gòu)損傷，造成滲出液的可溶性糖含量增加。朱世東和黎世昌[37]指出,老化洋蔥(A.cepa)種子浸出液電導(dǎo)率增加的同時(shí)，浸出液可溶性糖也有所增加。本研究結(jié)果表明，隨著老化的進(jìn)行可溶性糖含量逐漸增大，在老化初期與正常種子相比變化不大，認(rèn)為可能是由于在老化初期種子經(jīng)過短暫自我修復(fù)，膜的傷害程度相對(duì)較小，可溶性糖作為電導(dǎo)率浸出液的成分之一，影響較小。在處理后起，質(zhì)膜的透性增大，種子受傷害的程度增加，可溶性糖量損失增加。本研究中證實(shí)電導(dǎo)率的變化受浸出液可溶性糖含量變化的影響。

4 結(jié)論

種子浸出液隨著老化程度的加大逐漸升高，且溫度越高增加越快，對(duì)膜的損傷程度越大，老化影響了羅布麻種子的膜系統(tǒng)，增加了細(xì)胞膜的滲透性，造成可溶性糖的滲漏。電導(dǎo)率的變化和浸出液糖含量有著直接的關(guān)系，電導(dǎo)率和可溶性含糖量的大小能反映出羅布麻細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性程度，可以作為快速測(cè)定羅布麻種子老化生理指標(biāo)。

人工老化過程中脫氫酶活性降低，脫氫酶不耐高溫在50 ℃條件下短時(shí)間內(nèi)活性完全喪失，對(duì)老化反應(yīng)比較敏感，溫度越高對(duì)脫氫酶活性影響越大。POD活性在50 ℃老化條件下大于35 ℃，說明羅布麻種子能夠?qū)Ω邷乩匣h(huán)境作出抗逆反應(yīng)，種子抗熱性較強(qiáng)。

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