南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素的分離與鑒定

王 帥，吳書(shū)奇，胡建軍，張 玲，馬春暉

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

小花棘豆(Oxytropisglabra)是豆科棘豆屬植物，有醉馬草(新疆策勒、輪臺(tái))、苦馬豆(新疆莎車(chē))等多種俗稱(chēng)[1-3]。在牧草缺乏的冬季和初春，家畜如果大量采食，就會(huì)引起中毒甚至死亡。新疆阿克蘇地區(qū)每年因采食小花棘豆中毒而死亡的家畜占5%～10%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%[2]，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。

近年來(lái)，有學(xué)者對(duì)小花棘豆的毒性成分進(jìn)行了研究。目前認(rèn)為小花棘豆的有毒成分可分為三類(lèi)[3-4]，即脂肪族硝基化合物、硒及硒化合物、生物堿類(lèi)物質(zhì)。葛鵬斌等[4]從小花棘豆中成功分離到苦馬豆素，并認(rèn)為內(nèi)蒙古小花棘豆的主要有毒成分不是脂肪族硝基化合物和硒類(lèi)化合物。王占新[5]認(rèn)為寧夏小花棘豆的主要毒性成分是苦馬豆素。但小花棘豆物候期、生長(zhǎng)地域、生長(zhǎng)年限等的不同會(huì)導(dǎo)致其毒性物質(zhì)含量的明顯差異[6]。與寧夏小花棘豆[5]相比，新疆南疆地區(qū)小花棘豆中不含蒽醌和香豆素類(lèi)物質(zhì)，酚類(lèi)和生物堿類(lèi)化合物的組成也存在著一定的差異[7]。目前對(duì)內(nèi)蒙古、寧夏等地的小花棘豆研究較多[4-8]，但尚無(wú)新疆南疆地區(qū)小花棘豆主要毒性成分的相關(guān)報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)新疆南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素的分離和鑒定，為新疆南疆地區(qū)家畜小花棘豆中毒的防治工作提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料 2010年8月，在新疆阿拉爾市托喀依鄉(xiāng)(40°33′24″ N，81°15′30″ E)隨機(jī)采集結(jié)實(shí)期的小花棘豆植株地上部分，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定后，陰干、粉碎、過(guò)20目篩。

1.1.2試驗(yàn)試劑 吡啶(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA)；雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1)，氘代氯仿(CDCl3)(均為美國(guó)SUPELCO)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3試驗(yàn)儀器 X-6型精密顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京福凱儀器有限公司)；Carry100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Varian)；Nicolet380(k)型傅立葉紅外光譜分析儀(美國(guó)熱電)；TRACE GC ULTRA DSQ型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)菲尼根)；AVANCE NANOBAY型核磁共振譜儀(德國(guó)BRUKER)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1苦馬豆素的分離 稱(chēng)取小花棘豆干粉5 kg，用0.1 mol/L稀鹽酸浸泡3次，每次12 h，過(guò)濾后合并濾液，濾液過(guò)已處理完全的732強(qiáng)酸性氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。用1 mol/L 氨水洗脫，結(jié)合碘化鉍鉀監(jiān)測(cè)直至生物堿檢測(cè)為陰性，濃縮后烘干。使用氯仿多次溶解，過(guò)濾，回收氯仿后即得到總生物堿。將總堿用甲醇完全溶解，過(guò)濾，回收甲醇后的殘留物上180 μm硅膠柱，使用氯仿∶甲醇∶氨水∶水(體積比為70∶26∶2∶2)混合溶劑洗脫，每10 mL收集一份，薄層層析檢測(cè)，合并同類(lèi)項(xiàng)，揮干后殘留物在90 ℃、-0.094 MPa真空條件下升華。對(duì)得到的白色結(jié)晶物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2薄層層析檢測(cè) 采用常規(guī)方法制備硅膠板，將待測(cè)樣品與苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于少量甲醇中，用毛細(xì)管吸取微量溶液點(diǎn)于硅膠板上，展開(kāi)劑體系為以下3種，分別為丙酮∶蒸餾水∶氨水(體積比為6∶1∶1)、氯仿∶甲醇∶氨水∶蒸餾水(體積比為70∶26∶2∶2)、乙酸乙酯∶乙醇∶氨水(體積比為4∶1∶1)[7-8]。上行法展開(kāi)，取出待溶劑完全揮干后，均勻噴灑10% H2O2，待完全揮干后置于105 ℃電熱板上加熱10 min，取下放涼；再均勻噴灑10%乙酸酐乙醇溶液，完全揮干后置于105 ℃電熱板上加熱10 min，待無(wú)酸味后取下放涼；最后均勻噴灑Ehrlich’s試劑，待完全揮干后置于115 ℃電熱板上顯色10 min。記錄各板斑點(diǎn)形狀、顏色，并計(jì)算Rf值。

1.2.3分離物鑒定 經(jīng)熔點(diǎn)(MP)測(cè)定、紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)及核磁共振(NMR)分析，比較文獻(xiàn)資料[4-6,8-13]，并與苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照分析，鑒定提取物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1提取率 共得到白色晶體質(zhì)量為99.74 mg，經(jīng)計(jì)算樣品提取率為19.95 mg/kg。

2.2薄層層析檢測(cè) 將此白色結(jié)晶物與苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品在3種不同的展開(kāi)劑體系下于同一條件下上行法展開(kāi)并顯色(圖1)。在氯仿∶甲醇∶氨水∶蒸餾水(體積比為70∶26∶2∶2)展開(kāi)劑條件下，樣品Rf值(Ehrlich’s試劑顯色)分別為0.486(紫色)和0.487(紫色)；在丙酮∶蒸餾水∶氨水(體積比為 6∶1∶1)展開(kāi)劑條件下，樣品Rf值分別為0.502(紫色)和0.504(紫色)；在乙醇∶乙酸乙酯∶氨水(體積比為1∶4∶1)展開(kāi)劑條件下，樣品Rf值均為0.499(紫色)。二者展開(kāi)后所得的斑點(diǎn)形狀、顏色均相同，Rf值相近，初步確認(rèn)此白色結(jié)晶物為苦馬豆素。

2.3分離物鑒定 分離得到的白色結(jié)晶物熔點(diǎn)為145 ℃；紫外-可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描(溶劑為丙酮)最大吸收峰為210 nm(圖2)。IR 最大吸收峰(KBr壓片，cm-1，圖3)為3 423.83(-OH吸收峰)，2 943.64、2 886.32(均為-CH吸收峰)，1 316.25 (-CN吸收峰)，1 072.59(C-O吸收峰)；2 828.85～2 724.00 cm-1出現(xiàn)的譜帶判斷為Bohlman Band，說(shuō)明樣品中存在trans CH-N的吸收，與資料報(bào)道[9-11]的苦馬豆素的兩環(huán)結(jié)構(gòu)相符合。GC-MS[BSTFA+TMCS(99∶1)衍生處理，質(zhì)荷比，圖4]為173(分子離子峰)，155(173-H2O)，138(155-OH)，113、96、72、43(均為母核裂解碎片峰)；質(zhì)子裂解與資料報(bào)道的質(zhì)譜圖一致[9-11]。1HNMR(400 MHz，CDCl3，CDCl3兼做內(nèi)標(biāo))：δ1.228(qd，J=4.0和12.8 Hz，H-7ax)；δ1.504(qt，J=4.0 和13.2 Hz，H-6ax)，δ1.708(br，d，J=13.6 Hz，H-6eq)，δ1.918(m，J=3.6和12.8 Hz，H-5ax)，δ1.945(m，H-8a)，δ2.031(m，H-7eq)，δ2.543(dd，J=8.0和11.2 Hz，H-3ax)，δ2.868(dd，J=2.0和8.0 Hz，H-3eq)，δ2.896(m，H-5eq)，δ3.792(td，J=4.4和10.4 Hz，H-8)，δ4.245(dd，J=4.0和5.6 Hz，H-1)，δ4.340(m，J=2.0和8.0 Hz，H-2)，δ7.26(內(nèi)標(biāo))。13CNMR(100 MHz，CDCl3，CDCl3兼做內(nèi)標(biāo))：δ25.5(C-6)，δ34.8(C-7)，δ54.0(C-5)，δ62.9(C-7)，δ68.7(C-8a)，δ71.4(C-8)，δ72.0(C-1)，δ75.1(C-2)，δ77.0(內(nèi)標(biāo))，與文獻(xiàn)資料報(bào)道的苦馬豆素核磁譜數(shù)據(jù)一致[9-11]。

圖1 待測(cè)樣品在3種展開(kāi)劑中展開(kāi)并顯色

圖2 待測(cè)樣品全波長(zhǎng)(190～800 nm)掃描結(jié)果

圖3 待測(cè)樣品的紅外色譜圖

圖4 待測(cè)樣品的質(zhì)譜圖

3 討論與小結(jié)

3.1苦馬豆素不同提取方法的比較 苦馬豆素的傳統(tǒng)提取工藝為大體積的乙醇或甲醇溶液浸提，然后使用一系列極性不同的有機(jī)溶劑萃取。整個(gè)操作過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，成本較高[9-10]。本研究采用稀鹽酸浸提，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離，無(wú)需消耗大量的有機(jī)溶劑，提取時(shí)間也可大大縮短。另外，苦馬豆素的極性較大[9-11]，相對(duì)于醇類(lèi)溶劑，苦馬豆素更易溶于水。傳統(tǒng)方法苦馬豆素提取率為14～16 mg/kg[7-8]，本方法提取率為19.95 mg/kg，明顯高于傳統(tǒng)方法。本方法節(jié)約了大量有機(jī)溶劑，而且在提取過(guò)程中沒(méi)有長(zhǎng)時(shí)間加熱，最大程度的保存了植物中的苦馬豆素，適合于批量提取植物中的苦馬豆素。

3.2分析化學(xué)中不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定方法的比較 目前有機(jī)結(jié)構(gòu)化學(xué)中的常見(jiàn)方法有薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振等。薄層色譜分析簡(jiǎn)單快捷，定性準(zhǔn)確，常用于分離過(guò)程中的適時(shí)檢測(cè)；質(zhì)譜試驗(yàn)可以得到化合物的分子量，并且通過(guò)裂解方式提供分子的結(jié)構(gòu)信息[11-13]；對(duì)于分子量在1 000以下的化合物一般單用核磁共振分析就可以確定其結(jié)構(gòu)[12]；而一些分子量很大，結(jié)構(gòu)也非常復(fù)雜的微量成分，若能得到良好的單晶(每邊不少于0.1 mm)，可單獨(dú)使用X射線(xiàn)單晶衍射的方法快速確定整個(gè)分子的立體結(jié)構(gòu)[12-13]。對(duì)于已知化合物鑒定，最方便的方法是找到對(duì)照樣品及其紅外光譜圖譜。但本研究的對(duì)照品苦馬豆素價(jià)格昂貴，而文獻(xiàn)中關(guān)于苦馬豆素的紅外光譜數(shù)據(jù)只有幾個(gè)最大吸收峰[4,7-9]，這對(duì)于化合物的結(jié)構(gòu)鑒定是不夠的。故本研究采用氣相色譜分離-質(zhì)譜測(cè)定的方法檢測(cè)分離樣品的分子量，核磁共振圖譜檢測(cè)分離樣品的分子結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用乙醇提取，柱層析分離，升華法從小花棘豆草粉中得到99.74 mg白色晶體，提取率為19.95 mg/kg；經(jīng)薄層色譜、熔點(diǎn)、紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振鑒定，確定該白色晶體為苦馬豆素。

[1]中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)高等植物圖鑒(第二冊(cè))[M].北京：科學(xué)出版社,2002.

[2]高木木.新疆棘豆屬植物研究[D].石河子:石河子大學(xué),2008.

[3]盧萍,趙萌莉,韓國(guó)棟,等.小花棘豆毒性的危害與利用[J].草業(yè)科學(xué),2009,26(3):97-101.

[4]葛鵬斌,趙寶玉,童德文,等.小花棘豆中苦馬豆素的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2003,19(1):1-4.

[5]王占新.小花棘豆化學(xué)成分、營(yíng)養(yǎng)成分評(píng)價(jià)及瘋草苦馬豆素動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2010.

[6]曾惠玲.中藥化學(xué)成分提取新技術(shù)研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2005,17(5):1-3.

[7]王帥,胡建軍,阿里木別克,等.南疆地區(qū)小花棘豆的營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(5):136-139.

[8]崔忠華.酶法和氣相色譜法測(cè)定苦馬豆素含量的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[9]李勤凡,王建華,劉志濱,等.萃取法提取甘肅棘豆中的苦馬豆素研究初報(bào)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005,21(5):143-145.

[10]李錫杰,張偉,楊鳴琦,等.金龜子綠僵菌中苦馬豆素的分離與鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(2):35-39.

[11]Cook D,Gardner D R,Grum D,etal.Swainsonine and endophyte relationships inAstragalusmollissimusandAstragaluslentiginosus[J].Jaurnal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(4):1281-1287.

[12]Chooprayoon S,Kuhakarn C,Tuchinda P,etal.Asymmetric total synthesis of (+)-swainsonine[J].Organic and Biomolecular Chemistry,2011,9(2):531-537.

[13]Gardner D R,Cook D.A comparison of alternative sample preparation procedures for the analysis of swainsonine using LC-MS/MS[J].Phytochemical Analysis PCA,2010,22(2):124-127.