乳鐵蛋白素B和天蠶素P1對投喂大腸桿菌斷奶仔豬生長及腸道微生物區(qū)系的影響

侯振平 印遇龍 王文杰 劉景喜 SOUFFRANTW B

(1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112;2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125;3.德國家畜生物研究所，Dummerstorf D- 18196)

乳鐵蛋白素B和天蠶素P1對投喂大腸桿菌斷奶仔豬生長及腸道微生物區(qū)系的影響

侯振平1印遇龍2王文杰1劉景喜1SOUFFRANTW B3

(1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112;2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125;3.德國家畜生物研究所，Dummerstorf D- 18196)

本研究旨在探討投喂大腸桿菌后乳鐵蛋白素B(Lfcin B)和天蠶素P1(Cec P1)對斷奶仔豬生長及腸道微生物區(qū)系影響。選用48頭28日齡斷奶的德國大白雜交二代斷奶仔豬［(7.18±1.32)kg］，根據(jù)體重、窩別、性別將其隨機(jī)分成 4 組:對照組、產(chǎn)腸毒素組(ETEC)、乳鐵蛋白素組(Lfcin B)、天蠶素組(Cec P1)，每組2個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬，試驗期為12 d。結(jié)果表明，1)試驗期間對照組、ETEC組、Lfcin B組、Cec P1組仔豬體重及平均日增重均差異不顯著(P＞0.05)。2)ETEC組仔豬腹瀉率顯著高于其他組(P＜0.05)，而其他組之間差異不顯著(P＞0.05)。在進(jìn)行第1次攻毒后，即仔豬29日齡，ETEC組、Lfcin B組和Cec P1組仔豬的糞便干物質(zhì)均顯著下降(P＜0.05)，第2次攻毒后的第2天，即仔豬31日齡，Lfcin B組和Cec P1組的仔豬分別飼喂了Lfcin B和Cec P1，對照組仔豬的糞便干物質(zhì)仍顯著高于ETEC組和Lfcin B組(P＜0.05)，但已與Cec P1組差異不顯著(P＞0.05)。3)各組仔豬的腸道微生物區(qū)系差異不顯著(P＞0.05)。由此可知，各組仔豬生長及腸道微生物區(qū)系差異不顯著，但Cec P1來源于豬腸道微生物寄生線蟲，比Lfcin B更能適應(yīng)腸道環(huán)境，更有利于仔豬健康。

Lfcin B;Cec P 1;ETEC;斷奶仔豬;腸道;微生物區(qū)系

乳鐵蛋白素B(lactoferricin B，Lfcin B)是從牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin，BLF)的 N端(17～41)被胃蛋白酶水解下來的25個氨基酸殘基，其中的11個氨基酸殘基具有與完整的Lfcin B相同的抗菌活性，雖然沒有鐵離子結(jié)合位點，但殺菌活性甚至比乳鐵蛋白(LF)高［3-5］。天蠶素 P1(cecropin P1，Cec P1)是第1個從豬腸微生物寄生蟲中分離出的抗菌肽［6］，由31個氨基酸組成，其氨基酸序列為SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR，與昆蟲Cec A和Cec B分別有64%和75%的相似性。

目前有很多關(guān)于Lfcin B和Cec P1的表達(dá)載體構(gòu)建和體外活性測定［7-17］，但關(guān)于Lfcin B在動物生產(chǎn)應(yīng)用上的報道很少，甚至沒有關(guān)于Cec P1在動物生產(chǎn)應(yīng)用上的報道，更是鮮有Lfcin B和Cec P1在動物生產(chǎn)應(yīng)用上的比較。本研究旨在通過研究投喂大腸桿菌后Lfcin B和Cec P1對斷奶仔豬生長及腸道微生物區(qū)系的影響，為抗菌肽在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼糧

試驗選用28日齡的德國大白雜交二代斷奶仔豬［(7.18 ±1.32)kg］48 頭，其飼糧由德國家畜微生物所動物營養(yǎng)與生理研究室提供，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，Lfcin B和Cec P1濃度均為1 mg/μL，由德國基因橋公司提供。

1.2 試驗設(shè)計、飼養(yǎng)管理及樣品采集

根據(jù)體重、窩別、性別將48頭斷奶仔豬隨機(jī)分成4組:對照組、產(chǎn)腸毒素組［飼喂腸產(chǎn)毒性大腸 埃 希 菌 (enterotoxigenicEscherichiacoli，O149∶K91∶F4ac)，ETEC 組］、乳鐵蛋白素組(Lfcin B組)、天蠶素組(Cec P1組)，每組2個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬，試驗期為12 d。試驗的第1、2天(即仔豬28、29日齡)禁食，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet

每天08:00和16:00飼喂，自由飲水，記錄飼料剩余情況和糞指數(shù)(評判方法:水樣糞便為 1;軟而成型為 2;堅硬為 3;非常堅硬為4)、腹瀉情況(糞指數(shù)為1～2，包括1，定為腹瀉)、死亡頭數(shù)，并逐只稱重，計算腹瀉率和平均日增重。除試驗第1天(28日齡)不采集糞樣外，以后每天都采集新鮮糞樣，-20℃保存，以備測定糞便干物質(zhì)含量及提取DNA。

1.3 攻毒試驗

在仔豬29日齡的08:00，除對照組的仔豬外，ETEC組、Lfcin B組、Cec P1組的每頭仔豬飼喂4.2 ×109CFU/m L ETEC。

伴隨著e航海戰(zhàn)略的發(fā)展，MS服務(wù)必將朝著協(xié)調(diào)統(tǒng)一、安全高效、單一窗口的方向發(fā)展。在這一發(fā)展進(jìn)程中，航海保障部門無論是從國家政策、戰(zhàn)略布局，還是技術(shù)理論及角色定位等方面，理應(yīng)擔(dān)負(fù)起MS服務(wù)區(qū)域協(xié)調(diào)人的角色。在協(xié)調(diào)各方信息資源的同時，更好地實施e航海戰(zhàn)略，推進(jìn)智能化助航服務(wù)的發(fā)展。

在仔豬30日齡06:00開始提供飼料，在給ETEC、Lfcin B、Cec P1飼喂 5.5×109CFU/m L 的ETEC 2 h后(08:00)，用一次性注射器給Lfcin B組的每頭仔豬口服飼喂2 mg Lfcin B，Cec P1組的每頭仔豬口服飼喂2 mg Cec P1。

1.4 樣品分析

1.4.1 干物質(zhì)的測定

稱取1 g新鮮的糞樣于陶瓷平皿中，放入恒溫烘箱，60℃烘24 h，然后再105℃烘3 h，稱量剩余物質(zhì)的重量。

1.4.2 DNA提取、濃度測定及樣品處理

取200 mg新鮮糞樣，按照試劑盒的操作說明進(jìn)行細(xì)菌總DNA提取，使用美國NanoDropND-1000 DNA/RNA/蛋白質(zhì)濃度測定儀測DNA濃度，根據(jù)濃度大小及稀釋倍數(shù)，換算成待測DNA濃度，并把管中DNA作相應(yīng)稀釋，以20 ng/μL分裝，于-20℃保存。根據(jù)記錄的A260/A230，估測 DNA 質(zhì)量，一般 A260/A280 在 1.6 ～1.8，蛋白質(zhì)含量為0時可以滿足本試驗要求。樣品分析采用的是每天每組每頭豬糞樣DNA按照濃度1∶1的比例混合而成的樣品。

1.4.3 腸道微生物區(qū)系的測定

本試驗參考 Nübel等［18］和 Felske 等［19］發(fā)表的引物，引物 S-D-Bact-0008和 Uni-1492-R用作PCR-16S rRNA擴(kuò)增，S-D-Bact-0968-GC和 S-DBact-1401用作PCR-DGGE擴(kuò)增。引物由英國Invitrogen生物公司合成，超純水溶解，-20℃保存。

用nested-PCR進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，按照前人報道的方法［20-21］進(jìn)行DGGE的配制和電泳及膠的染色、照相。每個樣品都重復(fù)3次，然后取平均值。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗得到的圖片用BioNumerics 5.0進(jìn)行分析，然后用 Canoco 4.5［22-23］統(tǒng)計分析得到的數(shù)據(jù)，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Statistica 6.0［24］(ANOVA HSD-test)進(jìn)行差異性顯著分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 L fcin B和Cec P1對斷奶仔豬體重和平均日增重的影響

由表2可知，對照組、ETEC組、Lfcin B組和Cec P1組仔豬體重和平均日增重差異不顯著(P＞0.05)。但在仔豬29～30日齡攻毒期、31～39日齡恢復(fù)期及整個試驗階段來看，對照組仔豬保持較高的平均日增重，Cec P1組次之。

2.2 L fcin B和Cec P1對斷奶仔豬腹瀉的影響

給28日齡斷奶仔豬投喂大腸桿菌后，Lfcin B和Cec P1對仔豬腹瀉的影響分別見表3、圖1和表4。

由表3可見，ETEC組仔豬腹瀉率顯著高于其他組(P＜0.05)，而其他組之間差異不顯著(P＞0.05)。從圖1可知，Lfcin B、Cec P1對糞指數(shù)的影響不顯著(P＞0.05)。由表4可以看出，在進(jìn)行第1次攻毒后，即仔豬29日齡，ETEC組、Lfcin B組和Cec P1組仔豬的糞便干物質(zhì)均顯著下降(P＜0.05)，說明本試驗進(jìn)行了比較成功的攻毒試驗。在進(jìn)行第2次攻毒后的第2天，即仔豬31日齡，Lfcin B組和Cec P1組的仔豬分別飼喂了Lfcin B和Cec P1，其糞便干物質(zhì)含量開始有所回升，對照組仔豬的糞便干物質(zhì)仍顯著高于ETEC組和Lfcin B組(P＜0.05)，但已與Cec P1組差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 Lfcin B和Cec P1對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系多樣性的影響

2.3.1 PCR-16S rRNA 擴(kuò)增結(jié)果

從新鮮糞樣中提取細(xì)菌總DNA，進(jìn)行PCR-16S rRNA的v6～v8區(qū)PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 484 bp(圖 2)。

表2 Lfcin B和Cec P1對斷奶仔豬體重和平均日增重的影響Table 2 Effects of Lfcin B and Cec P1 on body weight and average daily gain of weaned piglets

表3 L fcin B和Cec P1對斷奶仔豬腹瀉率的影響Table 3 Effects of Lfcin B and Cec P1 on diarrhea rate of weaned piglets

圖1 L fcin B和Cec P1對斷奶仔豬糞指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Lfcin B and Cec P1 on feces score of weaned piglets

表4 L fcin B和Cec P1對斷奶仔豬糞便干物質(zhì)含量的影響Table 4 Effects of Lfcin B and Cec P1 on the content of dry matter of feces in weaned piglets %

圖2 PCR-16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR product of PCR-16S rRNA

2.3.2 PCR-DGGE 擴(kuò)增結(jié)果

以PCR-16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR-DGGE擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為433 bp(圖3)。

圖3 PCR-DGGE擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR product of PCR-DGGE

2.4 Lfcin B和Cec P1對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系多樣性的影響

2.4.1 DGGE 電泳結(jié)果代表圖

圖4是以PCR-16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR-DGGE擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)55%PAGE、1×TAE、60℃ 16 h電泳的結(jié)果。

2.4.2 微生物區(qū)系多樣性統(tǒng)計分析結(jié)果

腸道微生物區(qū)系的多樣性，用以下幾種多樣性進(jìn)行描述:N2 diversity［23-24］:有效物種出現(xiàn)率;N1 richness:物種豐度(計算公式為N1=eH，H為Shannon’s diversity);N2/N1:特定樣品的平均組成;Number of species:樣品的豐度;Shannon’s diversity:大量單個物種的相對比例(計算公式為H=-Σpjlog(pj)，pj=Yj/SUM。SUM 為一個樣品的物種值的總和，Yj為樣品中第j個物種的數(shù)量)。

微生物區(qū)系多樣性統(tǒng)計結(jié)果見圖5、圖6、圖7、圖8。由圖可知，各組仔豬腸道微生物區(qū)系差異不顯著(P＞0.05)。不同日齡聚類分析結(jié)果見圖9，表明日齡對腸道微生物區(qū)系的多樣性起著相對的決定作用。

圖4 全組樣DGGE結(jié)果代表圖Fig.4 Representative images of denaturing gradient gel electrophoresis of real pool samples

圖5 樣品中有效物種出現(xiàn)率Fig.5 N2 diversity(effective species occurrences)of samples

圖6 樣品中特定樣品的平均組成Fig.6 N2/N1 evenness(compositional evenness of particular sample)of samples

圖7 樣品中物種的豐度Fig.7 Number of species(sample richness)of samples

圖8 樣品中大量單個物種的相對比例Fig.8 Shannon’s diversity(relative proportions of abundances of individual species)of samples

圖9 樣品聚類分析圖Fig.9 Cluster analysis of samples

3 討論

Lfcin B來源于乳鐵蛋白素(Lfcin)的酶解，而Lfcin存在于人及大多數(shù)哺乳動物的乳汁中，也存在于唾液、淚液、胰液以及其他的身體分泌物中。Cec P1是第1個從豬腸分離的抗菌肽，后經(jīng)研究者證實，Cec P1來源于豬腸道的寄生線蟲(Ascaris suum)［25］。因此，外源性添加Cec P1應(yīng)該比Lfcin B對豬腸道微生物的影響要大。體外試驗結(jié)果也表明，Lfcin B對來源于豬的ETEC的最小抑制濃度 (m inimum inhibition concentration，M IC)是8μg/m L，而Cec P1的M IC是6μg/m L。

仔豬在斷奶初期3～5 d，會出現(xiàn)腹瀉、食欲下降、生長停滯等斷奶綜合征，需要采取必要的措施緩解這種斷奶應(yīng)激，使斷奶仔豬早日進(jìn)入生長肥育角色，提高養(yǎng)豬生產(chǎn)效率。Wang等［26-27］研究表明，當(dāng)乳鐵蛋白與抗生素結(jié)合使用時，可以顯著提高斷奶仔豬的生長性能，降低腹瀉率，增加絨毛高度，降低隱窩深度。從本試驗結(jié)果可以看出，Cec P1對投喂大腸桿菌的斷奶仔豬早期生長性能的影響優(yōu)于Lfcin B，添加Cec P1更有利于仔豬從病理狀態(tài)恢復(fù)到正常生長狀態(tài)。本試驗的目的之一就是研究抗菌肽是否可以有效地降低仔豬斷奶腹瀉，從而緩解斷奶應(yīng)激。從對斷奶仔豬腹瀉率、糞指數(shù)和糞便干物質(zhì)含量的比較分析來看，添加抗菌肽Cec P1有降低仔豬腹瀉的趨勢，且Lfcin B組與對照組保持相同的腹瀉率(23%)。在后期恢復(fù)階段，Cec P1表現(xiàn)出更強(qiáng)的優(yōu)勢。由此可見Cec P1更有利于幫助斷奶仔豬度過早期斷奶綜合征階段。而本試驗中，除了對斷奶仔豬投喂ETEC外，并沒有結(jié)合抗生素使用，所以無法比較單獨使用Lfcin B、Cec P1與Lfcin B和抗生素及Cec P1和抗生素結(jié)合使用的效果。

有研究報道，乳鐵蛋白可以保護(hù)新生小鼠免受與腸道有關(guān)的系統(tǒng)性感染［28］。本試驗中，雖然對照組、ETEC組、Lfcin B組和Cec P1組投喂了大腸桿菌的斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的多樣性差異不顯著，但從整個試驗期微生物區(qū)系多樣性的變化趨勢來看，Lfcin B和Cec P1有利于保護(hù)投喂了大腸桿菌的仔豬腸道內(nèi)的有益微生物，維持相對正常的微生物區(qū)系，且Cec P1有優(yōu)于Lfcin B的趨勢。

在整個試驗過程中，對照組仔豬保持相對高的平均日增重、糞指數(shù)、糞便干物質(zhì)含量和相對豐富的微生物多樣性，而Cec P1次之，且有較低的腹瀉率，這點表明，Cec P1具有較強(qiáng)的抗菌性能，有助于仔豬生長發(fā)育。

4 結(jié)論

① 對照組、ETEC組、Lfcin B組和Cec P1組仔豬的生長及腸道微生物區(qū)系差異不顯著，但在某種程度上，抗菌肽能夠改善斷奶仔豬的生長性能，控制腹瀉率，提高糞便干物質(zhì)及糞指數(shù)，緩解斷奶應(yīng)激。

②Cec P1來源于豬腸道微生物寄生線蟲，比Lfcin B更能適應(yīng)腸道環(huán)境，更有利于仔豬健康。

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Author，HOU Zhenping，assistant professor，E-mail:hzp2006@126.com

(編輯 何麗霞)

Effects of Lactoferricin B and Cecropin P1 on G row th and Gut Microflora in Weaned Piglets Challenged with EnterotoxigenicEscherichia coli

HOU Zhenping1YIN Yulong2WANG Wenjie1LIU Jingxi1SOUFFRANTW B3
(1.Tianjin Institute of Husbandry and Veterinary Science，Tianjin300112，China;2.Institute of Subtropical and Agriculture，The Chinese Academy Sciences，Changsha410125，China;3.Leibniz Institute for Farm Animal Biology，Dummerstorf D-18196，Germany)

This experiment was conducted to study the effects of lactoferricin B(Lfcin B)and cecropin P1(Cec P1)on growth and gutm icroflora in weaned piglets after orally challenged with enterotoxigenicEscherichia coli(ETEC).Forty-eight28-day-old German Landrace×German Landraceweaned pigletswith average body weight of(7.18 ±1.32)kg were random ly assigned tofour dietary treatments(the control，ETEC，LfcinB，Cec P1)with two replicates per treatmentand six pigs per replicate.The feeding trial lasted for 12 days.The results showed as follows:1)there were no significant differences in body weight and average daily gain among control，ETEC，Lfcin B and Cec P1 group(P＞0.05).2)The incidence of diarrhea in ETEC group was significantly higher than that in the other groups(P＜0.05)，but there was no significant difference among control，Lfcin B and Cec P1 group(P＞0.05).A fter challenged with ETEC firstly，the content of dry matter in feces of 29-day-old weaned piglets in ETEC，Lfcin B and Cec P1 group was significantly decreased(P＜0.05)，and after challenged with ETEC secondly，the content of dry matter in feces of 31-day-old weaned piglets in ETEC and Lfcin B group was still significantly lower than that in the control group(P＜0.05)，but there was no significant difference between the control group and Cec P1 group.3)There was no significant difference in gutm icroflora among all groups(P＞0.05).In conclusion，there are no significant differences in the growth and gutm icroflora of weaned piglets among the control，ETEC，Lfcin B and Cec P1 group，however，because Cec P1 is separated from nematodeAscaris suumof gutm icrobe in pigs，it lives more easily in the gut than Lfcin B，and it ismore favourable to the health of piglets.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1536-1544］

Lfcin B;Cec P 1;ETEC;weaned piglet;gut;m icroflora

S816.7

A

1006-267X(2011)09-1536-09

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.012

2011-03-17

國家863項目(2008AA10Z316);國家自然科學(xué)基金面上項目(30700581);中德聯(lián)合培養(yǎng)博士項目

侯振平(1978—)，女，河南扶溝人，助理研究員，博士，主要研究方向為微生物與營養(yǎng)。E-mail:hzp2006@126.com