精氨酸對免疫應(yīng)激仔豬腸道組織Toll樣受體基因表達的影響

陳 渝 陳代文 毛湘冰 毛 倩 齊莎日娜 余 冰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)四川省重點實驗室，雅安 625014)

精氨酸對免疫應(yīng)激仔豬腸道組織Toll樣受體基因表達的影響

陳 渝 陳代文 毛湘冰 毛 倩 齊莎日娜 余 冰*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)四川省重點實驗室，雅安 625014)

本試驗旨在考察飼糧添加精氨酸(arginine，Arg)對免疫應(yīng)激仔豬生長性能和腸道組織細胞膜外Toll樣受體(TLR2、TLR4、TLR5、TLR6)基因表達的影響。選用(24±1)日齡的斷奶、平均體重(7.19±0.63)kg的杜洛克×長白×大白公豬20頭，隨機分為4個處理，分別為飼喂基礎(chǔ)飼糧+注射生理鹽水(對照組)、飼喂基礎(chǔ)飼糧 +注射沙門氏桿菌活疫苗(S.C500)(S.C500組)、飼喂基礎(chǔ)飼糧添加0.5%Arg+注射S.C500(0.5%A rg組)和飼喂基礎(chǔ)飼糧添加1.0%Arg+注射S.C500(1.0%Arg組)，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1頭仔豬。應(yīng)激處理于第8天實施，肌肉注射S.C500 4 m L。試驗期17 d。第8(免疫應(yīng)激前)、9、11、18天采集血樣測定血清沙門氏菌抗體水平和IL-6濃度，第18天仔豬屠宰采集空腸和回腸組織樣品，測定Toll樣受體mRNA表達量。結(jié)果表明:與對照組相比，仔豬肌肉注射S.C500不同程度地降低了平均日增重(ADG)(P＜0.10)和平均日采食量(ADFI)(P＜0.05)，顯著增加了在第9、11和18天血清IL-6濃度(P＜0.05)，同時顯著上調(diào)了空腸和回腸組織中TLR4和TLR5 mRNA表達量(P＜0.05);添加Arg(0.5%和1.0%)能夠緩減疫苗注射導(dǎo)致的以上抑制的效應(yīng)，顯著抑制了仔豬血清IL-6濃度、空腸和回腸TLR4和TLR5 mRNA表達量的上調(diào)(P＜0.05)。結(jié)果提示，飼糧添加Arg能顯著減緩因S.C500注射引起的斷奶仔豬腸道TLR4和TLR5基因的過度表達、血清IL-6濃度的升高，從而緩解免疫應(yīng)激對仔豬的損傷。

精氨酸;斷奶仔豬;免疫應(yīng)激;Toll樣受體

每年因疾病導(dǎo)致的豬只死亡不計其數(shù)，經(jīng)濟損失巨大。隨著飼用促生長抗生素因其對人類健康的危害而漸漸被禁用后，在飼糧中添加營養(yǎng)素來調(diào)控豬只自身的免疫力無疑成為了抵抗疾病的重要途徑之一［1］。精氨酸(arginine，Arg)是斷奶仔豬的必需氨基酸，飼糧中含有充足的Arg才能保證仔豬健康生長［2－4］。仔豬體內(nèi)Arg的降解主要發(fā)生在小腸，由精氨酸酶和一氧化氮合酶(NOS)將其分解為瓜氨酸、鳥氨酸、尿素和一氧化氮(NO)［5］。大量動物和人類試驗均表明，Arg作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑［6－7］，可通過促進胰島素、生長激素、類胰島素生長因子、白細胞介素－1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素 －12(interleukin-12，IL-12)、腫瘤壞死因子 － α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和 γ － 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)等內(nèi)分泌激素的分泌而介導(dǎo)對機體免疫功能的調(diào)節(jié)［8］。飼糧添加Arg能增強各種免疫應(yīng)激下動物的免疫功能［9－12］，從而降低因病原感染引起的動物發(fā)病和死亡。

細胞膜外 Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)，主 要 包 括 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6，是一類動物體內(nèi)模式識別受體(pattern rec-ognition receptor，PRR)，通過識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)介導(dǎo)天然免疫［13］。細胞膜外TLRs主要通過識別細菌的毒力成分并與之相結(jié)合，然后將該信號最終傳遞給核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)或絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，從而產(chǎn)生 TNF-α、IL-1、白細胞介素 －6(interleukin-6，IL-6)、IL-12 和 IFN-γ 等細胞因子來參與免疫調(diào)節(jié)［14］。當(dāng)細菌入侵動物機體時，細菌特有成分［如鞭毛、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)］刺激細胞膜外 TLRs(如 TLR4、TLR5)使得其mRNA水平上調(diào)［15－16］，同時伴隨著誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的 mRNA 水平上調(diào)［17］，iNOS 的功能是合成NO，這說明動物機體在應(yīng)激情況下需要NO來參與機體功能的調(diào)節(jié)。Arg作為動物體內(nèi)iNOS合成NO的唯一底物，并且在免疫功能上與TLRs調(diào)節(jié)著相同細胞因子，那么A rg是否與Toll受體介導(dǎo)的天然免疫存在密切聯(lián)系?因此，本試驗采用斷奶仔豬注射沙門氏菌疫苗建立免疫應(yīng)激模型，初步探討Arg與仔豬腸道細胞膜外TLRs基因表達的關(guān)系，為Arg的合理利用及尋求改善仔豬免疫能力的營養(yǎng)措施提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙門氏菌活疫苗(S.C500)購于山東綠都生物科技有限公司。

1.2 試驗動物及設(shè)計

試驗選用(24±1)日齡的斷奶、平均體重(7.19±0.63)kg的杜洛克×長白×大白去勢公豬20頭，隨機分為4個處理，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧+注射生理鹽水(對照組)、基礎(chǔ)飼糧+注射S.C500(S.C500組)、基礎(chǔ)飼糧 +0.5%Arg+注射S.C500(0.5%Arg 組)和基礎(chǔ)飼糧 +1.0%Arg+注射S.C500(1.0%Arg組)，每個處理 5個重復(fù)，每個重復(fù)1頭仔豬。試驗期17 d。

1.3 試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1998)進行配制。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。0.5%和1.0%Arg組分別以0.5%和1.0%的Arg等量替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 飼養(yǎng)管理

1.5 樣品采集

于試驗第8(疫苗注射前)、9、11、18天，全部仔豬空腹前腔靜脈采血10 m L，收集于離心管中，3 000 r/min離心15min，收集血清，－20℃冰箱保存。

第18天采血后，所有仔豬麻醉致死，迅速取出空腸和回腸，分別剪取整個腸道組織中段，并將樣品用液氮速凍后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 生長性能

平均日采食量(ADFI):試驗期間記錄每頭豬每天飼喂量，計算ADFI。

平均日增重(ADG):試驗期第8、18天稱量仔豬空腹體重，計算ADG。

料重比(F/G):由ADFI和ADG之比得出。

1.6.2 血清沙門氏菌抗體

采用HerdChek豬沙門氏菌抗體檢測試劑盒(購于愛德士生物科技股份有限公司)檢測第8、9、11、18天的血清沙門氏菌抗體水平，具體操作按試劑盒說明書進行，結(jié)果以吸光度百分比表示。

Thermodynamic Analysis of Supercritical Working Fluid Brayton Cycle ZHENG Kaiyun(42)

1.6.3 血清IL-6濃度

第8、9、11、18天血清中IL-6濃度采用豬 IL-6 ELISA試劑盒(R＆D，美國)進行測定。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.6.4 腸道TLRsmRNA表達量

空腸和回腸腸道片段組織總RNA提取按照Trizol試劑(TaKaRa，日本)說明書進行，提取的總RNA最后溶解于無RNA酶水(RNase Free dH2O，TaKaRa，日本)中。瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。核酸蛋白質(zhì)檢測儀(Beckman Du－800，CA，美國)于260 nm波長處檢測RNA濃度。cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMreagent kit，TaKaRa，日本);反應(yīng)體系 10 μL:2 μL 5 ×PrimeScriptTMBuffer，0.5 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix，0.5 μL Oligo dT Primer，0.5 μL Random 6 mers，4.5 μL RNase Free dH2O，2 μL Total RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù):37℃、15 m in;85℃、5 s。反應(yīng)結(jié)束后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時熒光定量PCR(real-time PCR)法測定空腸和回腸腸道組織中 TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 mRNA表達量。用CFX-96 real-time PCR System(Bio-Rad，美國)進行測定，反應(yīng)熒光染料為SYBRGreenⅠ(TaKaRa，日本)。反應(yīng)體系為10μL:5 μL SYBR Prem ix Ex TaqTMⅡ(2×)，1μL上游引物，1μL下游引物，2μL dH2O，1μL cDNA模板。利用NCBI搜索目的基因片段，運用Primer 5、Oligo 6.0軟件進行引物設(shè)計，送交大連寶生物公司合成，引物序列及參數(shù)見表2。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 s;95℃變性5 s;退火溫度下(表2)退火25 s;40個循環(huán)。用于檢測基因擴增產(chǎn)物特異性的熔解曲線反應(yīng)程序為:95℃、10 s;65℃、25 s;95℃、0 s(溫度變化速率為0.1℃ /s)。實時熒光定量測定方法參照文獻［18］，采用雙ΔCt+標準曲線擴增效率校正法，標準曲線采用10倍梯度稀釋法制作，每個樣品3個重復(fù)，內(nèi)參基因選用β－肌動蛋白(β-actin)。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

基因表達結(jié)果采用相對表達量的形式，以β-actin為內(nèi)參基因進行計算，具體方法參照文獻［18］。所有數(shù)據(jù)采用SAS 8.1單因素方差分析并進行Duncan氏多重比較。結(jié)果以平均值±標準誤表示，以P＜0.05為差異顯著標準。

2 結(jié)果

2.1 飼糧添加Arg對免疫應(yīng)激仔豬生長性能的影響

由表3可知，試驗期1～7 d，各組試豬ADFI、ADG和F/G差異不顯著(P＞0.05);在肌肉注射S.C500后，8～17 d與對照組相比，S.C500組仔豬 ADG 和 ADFI分別降低 14.5%(P＜0.10)、23.5%(P＜0.05)，添加 Arg(0.5% 和 1.0%)能夠緩減疫苗注射導(dǎo)致的以上抑制的效應(yīng)，其中0.5%Arg組仔豬 ADG 比S.C500組提高6.0%，F(xiàn)/G 無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 飼糧添加Arg對免疫應(yīng)激仔豬血清沙門氏菌抗體的影響

由表4可知，試驗第8天(注射S.C500前)，仔豬體內(nèi)沙門氏菌血清抗體處于一個極低水平(與注射疫苗后比)，各組之間無顯著差異(P＞0.05)。在注射S.C500后的3和10 d(試驗第11和18天)，S.C500組抗體水平顯著高于其他各組(P＜0.05)。0.5%Arg組在試驗第18 天和1.0%Arg組在試驗第11和18天的血清沙門氏菌抗體水平顯著高于對照組(P＜0.05)，顯著低于同時期S.C500組的血清抗體水平(P＜0.05)。

表2 實時熒光定量PCR引物序列及參數(shù)Table 2 Primer sequences and parameters for real-time PCR

表3 精氨酸對免疫應(yīng)激仔豬生長性能的影響Table 3 Effect of arginine supplementation on growth performance of weaned piglets under immune stress

表4 精氨酸對免疫應(yīng)激仔豬血清沙門氏菌抗體含量的影響Table 4 Effect of arginine supplementation on antibody content of Salmonella in serum of weaned piglets under immune stress %

2.3 飼糧添加Arg對免疫應(yīng)激仔豬血清IL-6的影響

由表5可知，試驗第8天(注射S.C500前)，各組仔豬血清IL-6濃度無顯著差異(P＞0.05)，Arg對IL-6濃度無顯著影響(P＞0.05)。注射S.C500后，試驗第9和11天，S.C500組較對照組仔豬體內(nèi)IL-6濃度又顯著上升(P＜0.05)，而0.5%Arg組和1.0%A rg組血清 IL-6濃度均顯著低于S.C500組(P＜0.05)，與對照組無顯著差異(P＞0.05)。試驗第18天，S.C500組血清IL-6濃度顯著高于其他各組(P＜0.05)，且0.5%Arg組血清IL-6濃度顯著低于對照組(P＜0.05)。

表5 精氨酸對免疫應(yīng)激仔豬血清IL-6濃度的影響Table 5 Effect of arginine supplementation on serum IL-6 concentration of weaned piglets under immune stress ng/m L

2.4 飼糧添加A rg對免疫應(yīng)激仔豬腸道TLR2、TLR4、TLR5和TLR6 m RNA表達量的影響

由圖1可見，注射S.C500后免疫應(yīng)激和A rg添加對仔豬空腸TLR2和TLR6 mRNA相對表達量無顯著影響(P＞0.05)。注射S.C500后，S.C500組空腸TLR4和TLR5 mRNA相對表達量顯著上調(diào)(P＜0.05)，而添加Arg能顯著降低因S.C500注射導(dǎo)致的TLR4和TLR5 mRNA相對表達量的上調(diào)，其相對表達量與對照組無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 仔豬空腸TLR2、TLR4、TLR5和TLR6 m RNA相對表達量Fig.1 Relative expression levels of TLR2，TLR4，TLR5，TLR6 mRNA in jejunum of weaned piglets

由圖2可見，注射S.C500后，免疫應(yīng)激和Arg添加對仔豬回腸TLR2和TLR6 mRNA相對表達量無顯著影響(P＞0.05)。注射S.C500后，S.C500組回腸TLR4和TLR5 mRNA相對表達量均顯著上調(diào)(P＜0.05)，但添加A rg能顯著降低因注射S.C500導(dǎo)致的TLR4和TLR5 mRNA相對表達量的上調(diào)(P＜0.05)。另外，0.5%A rg組和1.0%Arg組回腸TLR4 mRNA相對表達量均顯著高于對照組(P＜0.05)，顯著低于S.C500組(P＜0.05)，而TLR5 mRNA相對表達量則與對照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 仔豬回腸TLR2、TLR4、TLR5和TLR6 m RNA相對表達量Fig.2 Relative expression levels of TLR2，TLR4，TLR5 and TLR6 mRNA in ileum of weaned piglets

3 討論

本試驗根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果(仔豬的臨床表現(xiàn)、抗體和炎性細胞因子的產(chǎn)生情況)確定了沙門氏菌活疫苗(S.C500)的注射劑量為4 m L(推薦免疫劑量的4倍)。沙門氏菌的主要毒力因子是O抗原(LPS)和 H抗原(菌鞭毛)［19］，這些抗原能夠誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，分泌大量的炎性因子［13，20］。而本試驗仔豬血清抗體、IL-6 濃度等的變化也證明了該劑量的沙門氏菌疫苗能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)激。

Toll樣受體家族是一類介導(dǎo)天然免疫的模式識別受體家族，根據(jù)其處于細胞內(nèi)的位置不同分為細胞膜外和細胞膜內(nèi)Toll樣受體［14］，細胞膜外TLRs主 要 包 括 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5 和TLR6，它們通過自身形成同源二聚體或者與其他Toll樣受體形成異源二聚體，如 TLR1-TLR2、TLR2-TLR6、TLR4-TLR5［21］，用于細菌的特異性成分的識別，將該信號最終傳遞給 NF-κB或MAPK，從 而 產(chǎn) 生 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 和IFN-γ等細胞因子參與免疫調(diào)節(jié)［14］。但是這些細胞膜外TLRs被過度激活后也會傷害到動物自身，迫使機體產(chǎn)生炎性反應(yīng)給動物機體帶來負面影響［22－23］。由本試驗結(jié)果可知，注射S.C500 后，仔豬 ADFI下降、空腸和回腸組織中 TLR4和TLR5 mRNA表達量顯著上調(diào)，表明4 m L沙門氏菌活疫苗使得仔豬產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng);也說明腸道TLR4和TLR5已經(jīng)過度活化，而過度活化的Toll受體會誘導(dǎo)炎性因子大量產(chǎn)生［14，22－23］，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，這也可能是仔豬表現(xiàn)出現(xiàn)ADG和ADFI下降的重要原因。IL-6是細胞膜外TLRs受體被激活后會產(chǎn)生的一種細胞因子，是一種促炎遞質(zhì)，大量產(chǎn)生會加劇體內(nèi)炎性反應(yīng)，甚至導(dǎo)致一些疾病的惡化［24－25］。本試驗發(fā)現(xiàn)，S.C500 應(yīng)激后，仔豬血清IL-6濃度顯著增加。

飼糧添加Arg緩解了仔豬因沙門氏菌活疫苗注射導(dǎo)致的采食量下降，下調(diào)了腸道TLR4和TLR5的過度表達，降低了血液IL-6水平。說明Arg能夠以某種途徑影響腸道TLR4和TLR5的表達，進而緩減IL-6等炎性因子的生成。前人也有研究發(fā)現(xiàn)，在含1.2%左右Arg的基礎(chǔ)飼糧中額外添加0.5%和1.0%Arg能夠緩解由應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬腸道損害［26－27］。Arg是通過何種途徑下調(diào)應(yīng)激仔豬空腸和回腸組織中TLR4和TLR5基因的過度表達?研究發(fā)現(xiàn)，Arg主要在動物的小腸中進行分解代謝，在精氨酸酶和NOS的作用下轉(zhuǎn)化為鳥氨酸、瓜氨酸、尿素和 NO，且 Arg是 NOS分解產(chǎn)生NO的唯一底物［5］。在LPS致大鼠急性肺損傷的試驗中發(fā)現(xiàn)，讓大鼠吸入不同濃度的NO后，TLR4 mRNA相對表達量極顯著下調(diào)［28］。另外，在外界微生物刺激下，人鼻腔黏膜中TLR4 mRNA表達量顯著增加，同時iNOS mRNA也顯著上調(diào)［29］。而 K leeberger 等［17］、Rodriguez 等［30］、Forst等［31］均發(fā)現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)下的小鼠體內(nèi)TLRs與iNOSmRNA表達呈正相關(guān)的關(guān)系。所以在TLRs的基因過度表達時候，伴隨著iNOS也同時大量表達，iNOS是NOS的一種，其功能是催化Arg分解生成NO，在機體受到某些應(yīng)激刺激(如LPS應(yīng)激)的時候才會大量表達［32］。因此，可以推測本試驗中Arg對應(yīng)激狀態(tài)下空腸和回腸組織Toll樣受體過度表達的下調(diào)，可能與其降解為NO進而發(fā)揮作用有關(guān)。但是，具體途徑有待進一步研究。

另外，本試驗中仔豬空腸和回腸組織TLR2和TLR6在免疫應(yīng)激后mRNA表達量變化不明顯，可能的原因是TLR2和TLR6識別的配體主要是細菌的脂肽［14］，而本試驗所用沙門氏菌活疫苗的毒力因子主要是LPS和鞭毛，因此未能激活TLR2和TLR6。

4 結(jié)論

飼糧添加Arg能顯著減緩因S.C500注射引起的斷奶仔豬腸道TLR4和TLR5基因的過度表達、血清IL-6濃度的升高，從而緩解免疫應(yīng)激對仔豬的損傷。

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*Corresponding author，associate professor，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn

(編輯 王智航)

Effect of Arginine Supp lem entation on Genes Expression of Toll-like Receptors in Intestinal Tissues of Weaned Piglets under Imm une Stress

CHEN Yu CHEN Daiwen MAO Xiangbing MAO Qian QISharina YU Bing*
(Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Animal Disease-resistance Nutrition Key Laboratory of Sichuan Province，Ya’an625014，China)

This trialwas conducted to study the effect of arginine(A rg)supplementation on growth performance and genes expression of cell-surface toll-like receptors(TLR2，TLR4，TLR5 and TLR6)in intestinal tissues of weaned piglets under immune stress.Twenty male weaned piglets［(Duroc×Landrace×Yorkshire)，(24 ±1)days of age，average body weight of(7.19 ±0.63)kg］were random ly assigned to 4 treatments with 5 replicates in each treatment and 1 piglet per replicate.Pigletswere fed basal diet+injected sterile saline(control group)，fed basal diet+injected live vaccine ofSalmonella choleraesuis500(S.C500)(S.C500 group)，fed basal diet supplemented with 0.5%Arg+injectedS.C500(0.5%A rg group)，and fed basal diet supplemented with 1.0%Arg+injectedS.C500(1.0%Arg group)，respectively.The injection of 4 m LS.C500 or sterile salinewas carried out on day 8.The trial lasted for 17 d.Blood sampleswere collected to determ ine serumSalmonellaantibody level and interleukin-6(IL-6)concentration on day 8(before injection)，day 9，day 11 and day 18.Piglets were slaughtered and jejunum and ileum tissue sampleswere collected for evaluation of mRNA expression levels of toll-like receptors on day 18.The results showed as follows:compared with the control group，injection ofS.C500 decreased the ADG(P＜0.10)and ADFI(P＜0.05)of piglets to a different extent，significantly increased serum IL-6 concentration on day 9，day 11 and day 18(P＜0.05)，aswell asmRNA expression levels of TLR4 and TLR5 in jejunum and ileum tissue(P＜0.05);Arg supplementation(0.5%and 1.0%)alleviated inhibitive effects induced byS.C500 challenge，decreased serum IL-6 concentration，and inhibited mRNA expression levels of TLR4 and TLR5 in jejunum and ileum tissue(P＜0.05).These results indicate that Arg supplementation can alleviate the over-expression of TLR4 and TLR5 mRNA in intestinal tissues and the excessive production of serum IL-6 induced byS.C500 challenge，which are beneficial to alleviating damage induced by immune stress.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1527-1535］

arginine;weaned piglet;immune stress;toll-like receptor

S828

A

1006-267X(2011)09-1527-09

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.011

2011－04－07

國家自然科學(xué)基金項目(30800787)

陳 渝(1985—)，男，重慶萬州人，碩士研究生，從事動物營養(yǎng)和飼料科學(xué)的研究。E-mail:g4hitboy@qq.com

*通訊作者:余 冰，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn