不同水平精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺對(duì)斷奶仔豬空腸體外酶活及細(xì)胞增殖與凋亡的影響

蔣 義 賈 剛 黃 蘭 吳彩梅 王康寧

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安 625014)

不同水平精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺對(duì)斷奶仔豬空腸體外酶活及細(xì)胞增殖與凋亡的影響

蔣 義 賈 剛*黃 蘭 吳彩梅 王康寧

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安 625014)

本試驗(yàn)旨在研究精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺(A rg-Gly-Gln)對(duì)斷奶仔豬空腸體外酶活及細(xì)胞增殖與凋亡的影響。試驗(yàn)采用單因子設(shè)計(jì)，設(shè)6個(gè)處理，培養(yǎng)液分別添加Arg-Gly-Gln 0、0.28、0.56、1.11、2.23、4.45 mmol/L，每個(gè)處理8 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 1 個(gè)空腸組織塊。檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活力、腸組織中谷氨酰胺酶和二胺氧化酶(DAO)活力以及5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrDU)、半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白水解酶-3(Caspase-3)陽(yáng)性細(xì)胞百分比的變化。結(jié)果表明:1)與無(wú)添加的培養(yǎng)液相比，除添加0.56、2.23 mmol/L Arg-Gly-Gln在6 h時(shí)以及添加1.11 mmol/L Arg-Gly-Gln在24 h時(shí)無(wú)顯著差異(P＞0.05)外，其余各時(shí)間點(diǎn)、各添加A rg-Gly-Gln的培養(yǎng)液中LDH活力均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)降低;2)與無(wú)添加的培養(yǎng)液相比，培養(yǎng)液添加1.11、2.23、4.45 mmol/L A rg-Gly-Gln空腸組織谷氨酰胺酶活力分別提高了 27.69%、46.15%、83.08%(P＜0.01)，培養(yǎng)液添加 2.23、4.45 mmol/L Arg-Gly-Gln 空腸組織DAO活力分別提高了66.34%和110.89%(P＜0.01);3)隨著培養(yǎng)液A rg-Gly-Gln水平的提高，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比增加，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞百分比降低。結(jié)果提示:Arg-Gly-Gln能夠緩解細(xì)胞損傷并降低細(xì)胞膜通透性，提高空腸組織谷氨酰胺酶和DAO的活力，增強(qiáng)腸細(xì)胞對(duì)Gln的利用;Arg-Gly-Gln能夠促進(jìn)斷奶仔豬離體空腸細(xì)胞增殖，抑制由Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而提高腸道黏膜的屏障功能。

精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺;斷奶仔豬;空腸;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

隨著小肽營(yíng)養(yǎng)研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到含谷氨酰胺(Gln)的小肽可能比Gln具有更強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)生理功能。含Gln的小肽不僅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、穩(wěn)定性好，還能夠改善腸道形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，提高消化酶的活力［1］，促進(jìn)腸細(xì)胞的增殖［2］，并緩解腸上皮細(xì)胞凋亡［3］。但這些研究主要針對(duì)含Gln的二肽［如精氨酸-谷氨酰胺(Arg-Gln)、甘氨酸-谷氨酰胺(Gly-Gln)］，Gln三肽是否也具有相同的腸營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)，尚缺乏相關(guān)報(bào)道。不同結(jié)構(gòu)的小肽與刷狀緣細(xì)胞膜小肽載體的親合能力有很大差異［4］，這可能會(huì)影響不同Gln小肽的吸收利用方式和速度，從而導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)生理功能出現(xiàn)差異。Huang等［5］研究表明，精氨酸 -甘氨酸 -谷氨酰胺(Arg-Gly-Gln)不僅能以完整三肽的形式被腸道吸收，其吸收速率及比率還顯著高于Gly-Gln、游離甘氨酸(Gly)和Gln，但其吸收后是否能夠影響腸組織相關(guān)酶活(或功能)以及腸黏膜上皮細(xì)胞增殖、凋亡，目前還尚不清楚。因此，本試驗(yàn)以離體培養(yǎng)斷奶仔豬空腸組織為模型，研究Arg-Gly-Gln對(duì)斷奶仔豬腸道代謝相關(guān)酶活以及對(duì)5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrDU)、半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白水解酶-3(Caspase-3)陽(yáng)性細(xì)胞比的影響。在了解Arg-Gly-Gln對(duì)腸組織相關(guān)酶活以及細(xì)胞增殖、凋亡影響基礎(chǔ)上，完善和豐富Gln小肽的腸營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)研究，并為開(kāi)發(fā)Gln小肽產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

2010年3月至2010年7月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教育部抗病營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

28日齡斷奶的PIC健康仔豬離體空腸;Arg-Gly-Gln(純度≥98%，杭州中肽生化);DMEM培養(yǎng)液(含L-谷氨酰胺 365 mg/L、甘氨酸18.75 mg/L、L-精氨酸鹽酸鹽 147.5 mg/L，美國(guó)Sigma)、BrdU、BrdU 抗體、Caspase-3 抗體、SABC試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);乳酸脫氫酶(LDH)、谷氨酰胺酶、二胺氧化酶(DAO)試劑盒(南京建成生物試劑有限公司)。

1.3 試驗(yàn)儀器

常規(guī)手術(shù)器械、pH計(jì)、24孔培養(yǎng)板、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)、紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus)、組織切片機(jī)(德國(guó) Leica)、倒置顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子設(shè)計(jì)，按Arg-Gly-Gln的濃度不同，設(shè)6個(gè)處理，Arg-Gly-Gln濃度分別為0、0.28、0.56、1.11、2.23、4.45 mmol/L。每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)腸組織塊，每2個(gè)重復(fù)1個(gè)培養(yǎng)孔。用于測(cè)定酶活和研究細(xì)胞增殖的組織培養(yǎng)48 h，用于研究細(xì)胞凋亡的組織培養(yǎng)96 h。

1.4.2 腸組織塊的制備

無(wú)菌條件下，將空腸剪成10 cm左右的腸段，用含200 U/m L青霉素、200μg/m L鏈霉素的PBS液漂洗后，將腸段切割成5 mm×5 mm的組織塊，置于含100 U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素和10%胎牛血清的無(wú)菌DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.3 培養(yǎng)、取樣及樣品處理

取各處理培養(yǎng)液1.5 m L加入24孔培養(yǎng)板中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱30 m in，然后將腸組織隨機(jī)分配到培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)板放在二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)，每24 h換培養(yǎng)液1次。用于增殖試驗(yàn)的組織在培養(yǎng)24 h后，用含100μmol/L BrdU的培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h;其余組織一直用不含BrdU的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)至 6、24、48、72、96 h，取少量培養(yǎng)液即刻分析LDH活力;96 h培養(yǎng)結(jié)束后，將用于檢測(cè)活力的組織放入液氮中保存12 h，然后取出并置于-70℃保存待測(cè);將用于研究細(xì)胞增殖和凋亡的組織用4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)固定，保存。

1.4.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

LDH酶、谷氨酰胺酶和DAO的活力測(cè)定參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。LDH活力單位定義:1 000 m L培養(yǎng)液在37℃與基質(zhì)作用15 m in，在反應(yīng)體系中每產(chǎn)生1μmol丙酮酸為1個(gè)酶活力單位;谷氨酰胺酶活力單位定義:37℃、pH 8.6時(shí)，每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol Gln至Glu所需的酶量為1個(gè)酶活力單位;DAO活力單位定義:37℃、pH 7.2時(shí)，每分鐘內(nèi)氧化1μmol腐胺所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

BrdU和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞百分比采用免疫組織化學(xué)染色，參照邱曙東等［6］的方法進(jìn)行。每個(gè)處理隨機(jī)選取3張切片，每張切片隨機(jī)選3～4個(gè)區(qū)域拍照，用Image-Pro Plus 6.0形態(tài)分析軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析，測(cè)定單位面積陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和單因素方差分析，結(jié)合Duncan氏法進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Arg-G ly-G ln對(duì)組織培養(yǎng)液中LDH活力的影響

由表1可知，組織培養(yǎng)液LDH活力的變化如下:6～24 h時(shí)逐漸升高，24 h時(shí)達(dá)到最高;24～72 h時(shí)逐漸降低，72 h達(dá)到最低;72～96 h時(shí)又有所增加。與無(wú)添加相比，除培養(yǎng)液添加0.56、2.23 mmol/L Arg-Gly-Gln在6 h時(shí)無(wú)顯著差異(P＞0.05)以及添加 1.11 mmol/L Arg-Gly-Gln在24 h時(shí)無(wú)顯著差異(P＞0.05)外，其余各時(shí)間點(diǎn)、各添加A rg-Gly-Gln的組織培養(yǎng)液中LDH活力均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)降低。

表1 A rg-G ly-G ln對(duì)空腸組織培養(yǎng)液LDH活力的影響Table 1 Effect of Arg-Gly-Gln on the LDH activity of jejunum tissue in culturemedium

2.2 Arg-G ly-G ln對(duì)谷氨酰胺酶和DAO活力的影響

由表2可知，與無(wú)添加相比，培養(yǎng)液添加0.28、0.56 mmol/L A rg-Gly-Gln 谷氨酰胺酶活力無(wú)顯著差異(P＞0.05)，培養(yǎng)液添加 1.11、2.23、4.45 mmol/L A rg-Gly-Gln谷氨酰胺活力分別提高了 27.69%、46.15% 、83.08%(P＜ 0.01)。與無(wú)添加 相 比，培 養(yǎng) 液 添 加 0.28、0.56 mmol/L Arg-Gly-Gln DAO活力無(wú)顯著差異(P＞0.05);添加量為1.11 mmol/L時(shí)DAO活力顯著高于添加量為0.28 mmol/L 時(shí)(P＜0.05)，但與添加量為0和0.56 mmol/L時(shí)相比無(wú)顯著差異(P＞0.05);與無(wú)添加相比，A rg-Gly-Gln添加量為 2.23、4.45 mmol/L時(shí)DAO活力分別提高了66.34%和110.89%(P＜0.01)。

2.3 BrdU免疫組化分析

培養(yǎng)48 h后，通過(guò)免疫組織化學(xué)法分析空腸組織中BrdU摻入細(xì)胞核的情況，發(fā)現(xiàn)BrdU免疫陽(yáng)性產(chǎn)物呈黃色，各組均有分布，主要定位于細(xì)胞核(圖1)。

圖1 BrdU免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞Fig.1 BrdU-positive cells stained by immunohistochem isty(400 × )

隨著培養(yǎng)液添加Arg-Gly-Gln水平的增加，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比逐漸增加，4.45 mmol/L時(shí)達(dá)到最高(表3)。與無(wú)添加相比，添加量為0.56 mmol/L時(shí)差異顯著(P＜0.05)，添加量高于1.11 mmol/L 后差異極顯著(P＜0.01)(表 3)。相關(guān)分析結(jié)果表明，培養(yǎng)液中Arg-Gly-Gln的濃度與BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比之間存在極顯著的相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

表3 Arg-G ly-G ln對(duì)空腸組織BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比的影響Table 3 Effect of Arg-Gly-Gln on the percentage of BrdU-positive cells in jejunum tissue %

2.4 Caspase-3免疫組化分析

通過(guò)免疫組織化學(xué)方法定性和半定量了細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)96 h后，Caspase-3免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物在各處理細(xì)胞中廣泛分布，主要定位于細(xì)胞漿中(圖2)。

隨著培養(yǎng)液添加Arg-Gly-Gln水平增加，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞百分比降低，但添加量為0.56和1.11 mmol/L 之間、2.23 和4.45 mmol/L之間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)(表4)。相關(guān)分析結(jié)果表明，培養(yǎng)液中Arg-Gly-Gln水平與Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞百分比之間存在極顯著的相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

3 討論

3.1 Arg-G ly-G ln對(duì)空腸組織細(xì)胞通透性的影響

LDH是存在于細(xì)胞漿內(nèi)參與糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化的一種催化酶［7］。進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，如果細(xì)胞受損，LDH會(huì)由細(xì)胞漏至培養(yǎng)液中。檢測(cè)離體培養(yǎng)液中LDH，可以客觀(guān)衡量細(xì)胞的受損程度［8］。本試驗(yàn)中，6 h時(shí)各Arg-Gly-Gln添加組的LDH活力較高，可能是腸組織塊制作過(guò)程中黏膜損傷導(dǎo)致的;6～24 h各Arg-Gly-Gln添加組LDH活力升高，可能是細(xì)胞損傷使LDH持續(xù)釋放到培養(yǎng)液的結(jié)果;24 h后，各Arg-Gly-Gln添加組的LDH活力下降，腸組織細(xì)胞自我修復(fù)使受損程度降低。隨著Arg-Gly-Gln水平升高各時(shí)間點(diǎn)的LDH活力降低，表明Arg-Gly-Gln可能降低了腸組織細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性并緩解了細(xì)胞的損傷程度。

圖2 Caspase-3免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞Fig.2 Caspase-3 positive cells stained by immunohistochem isty(400 × )

表4 Arg-G ly-G ln對(duì)空腸組織Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞百分比的影響Table 4 Effect of A rg-Gly-Gln on the percentage of Caspase-3-positive cells in jejunum tissue %

3.2 Arg-G ly-G ln對(duì)空腸組織代謝相關(guān)酶活力的影響

Gln是動(dòng)物血漿中含量最高的氨基酸，其在腸道黏膜上皮細(xì)胞代謝，不僅為腸黏膜細(xì)胞提供能源，并且為肝臟的糖原異生、尿素合成提供底物。Gln在腸黏膜上皮細(xì)胞的代謝主要靠線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的磷依賴(lài)性谷氨酰胺酶的分解作用［9］，調(diào)節(jié)該活力即可調(diào)節(jié) Gln的代謝［10］。謝建新等［11］發(fā)現(xiàn)，全腸外營(yíng)養(yǎng)供給的Gln能夠顯著增強(qiáng)大鼠小腸黏膜谷氨酰胺酶活力，從而促進(jìn)小腸黏膜細(xì)胞對(duì)Gln的代謝和多胺的生成，發(fā)揮其促進(jìn)小腸黏膜細(xì)胞分裂增殖以及防止小腸黏膜的萎縮的作用。Satoh等［12］發(fā)現(xiàn)Ala-Gln使小鼠術(shù)后谷氨酰胺酶活力及谷氨酰胺酶mRNA水平均顯著升高，表明Gln小肽能夠通過(guò)谷氨酰胺酶途徑促進(jìn)腸道適應(yīng)。本試驗(yàn) 中，培 養(yǎng) 液 添 加 Arg-Gly-Gln 1.11～4.45 mmol/L后，谷氨酰胺酶活力顯著提高，表明Arg-Gly-Gln可以通過(guò)提高谷氨酰胺活力增強(qiáng)空腸Gln的代 謝。這 與 Haque 等［13］、Tazuke 等［14］在Gln二肽上的研究結(jié)果一致。這可能是由于A(yíng)rg-Gly-Gln在吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，受到位于刷狀緣膜表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)肽酶的水解，產(chǎn)生Gln和Gly-Gln等其他二肽和氨基酸在發(fā)揮作用，至于以完整形式被吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的Arg-Gly-Gln是否發(fā)生了作用，有待進(jìn)一步研究。

DAO是一種位于哺乳動(dòng)物腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞漿中的細(xì)胞內(nèi)酶［15］，在組胺和多胺代謝中起作用，也與腸黏膜細(xì)胞核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)，可以作為黏膜損傷后腸道細(xì)胞成熟度和完整性的標(biāo)志酶［16］。DAO主要分布于腸道，以空腸和回腸活力最高［17-18］。腸黏膜細(xì)胞受損、壞死后該酶釋放入血，或隨壞死脫落的腸黏膜細(xì)胞進(jìn)入腸腔內(nèi)，導(dǎo)致血漿或腸腔DAO活力增高而腸黏膜內(nèi)DAO活力降低。腸黏膜緊密排布的上皮細(xì)胞是腸道屏障功能的重要組成部分，因此血漿中或黏膜中DAO活力的變化可以反映腸道的屏障功能。Li等［19］研究發(fā)現(xiàn)，Gln可以顯著降低創(chuàng)傷后大鼠血漿中的DAO活力并升高組織中的DAO活力，表明Gln能降低腸道的受損程度，促進(jìn)腸道的修復(fù)過(guò)程，從而提高腸道的屏障功能。本試驗(yàn)中，Arg-Gly-Gln 添加量為 2.23、4.45 mmol/L 時(shí)，黏膜中DAO活力分別提高了66.34%、110.89%。這提示一定濃度的Arg-Gly-Gln也具有類(lèi)似Gln的功能，能夠起到改善腸道屏障功能的作用。

3.3 Arg-G ly-G ln對(duì)空腸組織細(xì)胞增殖和凋亡的影響

Gln是快速增殖細(xì)胞(如腸道細(xì)胞和免疫細(xì)胞)的重要“燃料”，可改善結(jié)腸炎大鼠的屏障功能［20］，防止斷奶仔豬空腸絨毛萎縮，維持小腸黏膜的正常結(jié)構(gòu)和功能［21］。BrdU是DNA前體胸腺嘧啶類(lèi)似物，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)摻入細(xì)胞S期單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶，BrdU的摻入強(qiáng)度可反映細(xì)胞增殖的情況［22］。采用免疫組化染色法，結(jié)合圖像分析進(jìn)行評(píng)估BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比可以反映細(xì)胞增殖的情況情況［23］。本試驗(yàn)中，Arg-Gly-Gln可以促進(jìn)斷奶仔豬離體空腸上皮細(xì)胞增殖。這與 Scheppach 等［2］、Haynes等［3］在 Gln 和 A la-Gln上的研究結(jié)果相一致。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinylasparate specific proteinase，Caspase)是一類(lèi)與凋亡密切相關(guān)的蛋白酶家族。其中凋亡調(diào)控的主要執(zhí)行者Caspase-3在細(xì)胞凋亡通路中具有重要作用。采用免疫組化染色法，結(jié)合圖像分析進(jìn)行評(píng)估Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞百分比可以反映細(xì)胞的凋亡情況［24］。Erbil等［25］發(fā)現(xiàn)向大鼠飼喂 1 g/(kg·d)的Gln能夠顯著降低因輻射引起的Caspase-3增加，從而抑制腸上皮細(xì)胞的凋亡。在本試驗(yàn)中，隨著Arg-Gly-Gln水平增加，Caspase-3活力下降。這表明Arg-Gly-Gln具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，并存在劑量效應(yīng)。Arg-Gly-Gln能抑制細(xì)胞凋亡，可能與Arg-Gly-Gln吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中伴隨著Gly-Gln和游離Gln的釋放有關(guān)，Gly-Gln和游離Gln能促進(jìn)隱窩細(xì)胞增殖、增強(qiáng)了損傷腸黏膜的修復(fù)，從而降低黏膜細(xì)胞的凋亡［26］。以完整形式轉(zhuǎn)運(yùn)的 Arg-Gly-Gln能否直接降低細(xì)胞凋亡，還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

通過(guò)上述研究，可以發(fā)現(xiàn)A rg-Gly-Gln能夠顯著影響空腸組織代謝相關(guān)酶的活力，并能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡。某種程度上講，Arg-Gly-Gln執(zhí)行了Gly-Gln和游離Gln的功能。但不能由此斷定A rg-Gly-Gln的腸營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)是完全通過(guò)Gly-Gln和游離Gln實(shí)現(xiàn)的。這是因?yàn)锳 rg-Gly-Gln還能夠以完整三肽的形式被吸收。Arg-Gly-Gln發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)到底是完整的三肽形式，還是Gly-Gln和游離的Gln的形式，亦或者三者同時(shí)發(fā)揮效應(yīng)，還有待進(jìn)一步研究。Huang等［5］研究發(fā)現(xiàn)，初始濃度為 0.556 mmol/L、培養(yǎng)時(shí)間為40 m in時(shí)，Arg-Gly-Gln的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)比率顯著高于Gly-Gln和Gln。通過(guò)檢測(cè)黏膜液、漿膜液以及組織當(dāng)中的Arg-Gly-Gln、Gly-Gln和Gln含量發(fā)現(xiàn)，三肽組可以向動(dòng)物機(jī)體提供的Gln的量＞二肽＞氨基酸。在不完全了解Arg-Gly-Gln發(fā)揮生理效應(yīng)的形式時(shí)，以能提供的Gln的量來(lái)衡量其生理效應(yīng)，可以推論:相同濃度的Arg-Gly-Gln的生理效應(yīng)強(qiáng)于Gly-Gln和Gln。

另外，在A(yíng)rg-Gly-Gln吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中也伴隨著Arg和A rg-Gly的產(chǎn)生。A rg也能夠促進(jìn)腸細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞程序性死亡［27］。原因在于A(yíng)rg在腸道細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列代謝生成鳥(niǎo)氨酸和多胺，多胺能夠促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞的增殖和腸黏膜的發(fā)育;Arg還可以通過(guò)代謝途徑轉(zhuǎn)化為Gln發(fā)揮其生理功能。Arg-Gly-Gln能否通過(guò)Arg或者Arg-Gly來(lái)發(fā)揮作用，目前還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

①Arg-Gly-Gln能夠緩解細(xì)胞損傷并降低細(xì)胞膜通透性，提高空腸組織谷氨酰胺酶和DAO的活力，增強(qiáng)腸細(xì)胞對(duì)Gln的利用。

②A(yíng) rg-Gly-Gln可促進(jìn)促進(jìn)斷奶仔豬離體空腸細(xì)胞增殖，抑制由Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而提高腸道黏膜的屏障功能。

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*Corresponding author，professor，E-mail:jiagang700510@163.com

(編輯 王智航)

Effect of Different Arg-G ly-G ln Levels on Jejunum Enzyme Activities，Cell Proliferation and Apoptosis of Weaned Pigletsin vitro

JIANG Yi JIA Gang*HUANG Lan WU Caimei WANG Kangning
(Animal Nutrition Institute，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，China)

This trialwas conducted to study the effect of Arg-Gly-Gln on jejunum enzyme activities，cell proliferation and apoptosis of weaned pigletsin vitro.A single-factor design was adopted and six treatmentswere set，which were supplementation of Arg-Gly-Gln at0，0.28，0.56，1.11，2.23 and 4.45 mmol/L in culture medium，respectively.Therewere eight replicates in each treatment and one jejunum tissue block in each replicate.The activity of lactate dehydrogenase(LDH)in culture medium，activities of glutam inase and diam ine oxidase(DAO)in intestinal tissues，percentages of BrdU-positive cells and Caspase-3-positive cells were determ ined.The results showed as follows:1)compared with that in culturemedium without supplemental Arg-Gly-Gln，LDH activity in culturemedium supplemented with Arg-Gly-Gln at different time point significantly decreased(P＜0.05 orP＜0.01)，excluding the culture medium supplemented with A rg-Gly-Gln at 0.56，2.23 mmol/L at6 h(P＞0.05)and 1.11 mmol/L at 24 h(P＞0.05);2)compared with that in culture medium without supplemental Arg-Gly-Gln，glutam inase activity of jejunum tissue in culture medium supplemented with Arg-Gly-Gln at 1.11，2.23 and 4.45 mmol/L increased by 27.69%，46.15%and 83.08%(P＜0.01)，respectively，and DAO activity of jejunum tissue in culturemedium supplemented with A rg-Gly-Gln at2.23 and 4.45 mmol/L increased by 66.34%and 110.89%(P＜0.01)，respectively;3)with the increasing of Arg-Gly-Gln levels in culture medium，percentage of BrdU-positive cells increased，but that of caspase-3-positive cells reduced.The results indicate that Arg-Gly-Gln can not only alleviate cell damage and reduce cellmembrane permeability butalso enhance the glutam inase and DAO activities，and promote the utilization of glutam ine by intestinal cells.In addition，Arg-Gly-Gln can promote the cell proliferation of jejunum and inhibit apoptosismediated by Caspase-3，resulting in the enhancement of barricade function of intestinal mucousmembrane.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1475-1482］

Arg-Gly-Gln;weaned piglet;jejunum;cell proliferation;cell apoptosis

S826

A

1006-267X(2011)09-1475-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.004

2011-04-06

四川省杰出青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人資助計(jì)劃(2010JQ0043);四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計(jì)劃

蔣 義(1985—)，男，四川三臺(tái)人，碩士研究生，從事飼料資源開(kāi)發(fā)與高效利用研究。E-mail:570088434@qq.com

*通訊作者:賈 剛，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:jiagang700510@163.com