大鼠彌漫性軸索損傷腦干AQP4表達(dá)和磁共振彌散張量成像研究

馬春林，鄭文斌，詹伏蘭，孔令梅，張海都

(1.珠海市第二人民醫(yī)院影像科，廣東 珠海 519020；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院影像科，廣東 汕頭 515041）

彌漫性軸索損傷（Diffuse axonal injury，DAI）是指頭部遭受特殊鈍性外力產(chǎn)生突然加速-減速和/或旋轉(zhuǎn)運動時，在剪應(yīng)力的作用下，腦內(nèi)發(fā)生的廣泛分布的以神經(jīng)軸索斷裂為特征的一系列病理生理變化，是一種常見的閉合性腦外傷，其致殘率較高，是顱腦損傷后神經(jīng)、精神功能障礙的常見原因之一。近年來，我國交通事故日益增多，DAI呈明顯上升趨勢。

DAI后腦水腫是影響患者預(yù)后的重要原因，腦水腫發(fā)病機制與多種因子如水通道蛋白-4、基質(zhì)金屬蛋白酶、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2等有關(guān)，國內(nèi)外許多研究證實腦外傷后水通道蛋白AQP4在局部表達(dá)增高和腦水腫密切相關(guān)[1]，并且AQP4表達(dá)增高的區(qū)域和腦水腫出現(xiàn)的區(qū)域也一致。

磁共振彌散張量成像技術(shù) （Diffusion tensor imaging，DTI）不僅反映水分子的布朗運動，還可定量分析水分子在不同方向上擴散的各向異性。

本文通過復(fù)制大鼠DAI動物模型，利用DTI技術(shù)對大鼠DAI后腦干部早期表觀彌散系數(shù)（Apparent diffusion coefficient，ADC）、部分各向異性（Fractional anisotropy，F(xiàn)A）的變化進行觀察，研究AQP4在DAI早期腦水腫過程中的表達(dá)規(guī)律，探討DAI腦水腫病理基礎(chǔ)與AQP4表達(dá)的聯(lián)系，揭示AQP4的表達(dá)與DTI的相關(guān)性。為活體監(jiān)測DAI后腦水腫動態(tài)變化提供影像學(xué)依據(jù)，對指導(dǎo)臨床制訂有效治療方案具有很大意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康成年SD雄性大鼠48只，10周齡，體重280～320g，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。動物自由進食飲水。動物房7∶00～19∶00光暗交替，相對濕度55%，溫度22℃。動物適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。

1.1.2 主要試劑與藥品

硝酸銀：廣州化學(xué)試劑廠。水通道蛋白4（AQP4）（BA1560）：武漢博士德生物工程有限公司。羊抗兔IgG（ZDR-5306）：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB Kit（20x）（DAB-0031）：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。多聚賴氨酸：武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要實驗儀器

GE Signa HDx 1.5T超導(dǎo)磁共振成像儀，3英寸線圈。超純水機：850EB超純水系統(tǒng)，法國Millipore S.A.S。微量加樣器：德國Eppendorf公司，1ml、200μl、20μl、10μl、2μl。pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，Delta 320型。TK-C1481BEC病理色彩攝像頭：日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗方案

將大鼠隨機分為6組，對照組1組，DAI組5組，每小組8只。DAI組按照Marmarou自由落體致傷模型，分別于損傷后3、6、12、24、72h行MRI檢查，包括T1WI，T2WI，DTI。隨后立即處死，斷頭取腦，行病理學(xué)檢查，包括HE染色，嗜銀染色和AQP4免疫組化染色。對照組于MRI掃描后處死，行病理學(xué)檢查。比較各時間點各項檢查的變化。

1.2.2 動物模型

DAI模型制作：采用Marmarou自由落體致傷模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml蛐kg），麻醉后大鼠剪掉頂部毛發(fā)，將一元硬幣放置于頂骨上，大鼠俯臥于20cm厚的海綿床。500克鐵棒通過PVC管從1.8m高處自由墜落打擊硬幣，注意保持方向，使打擊力度垂直向下，防止硬幣位置移動。隨即撤離海綿床避免二次打擊。觀察大鼠行為改變（圖1）。

1.2.3 MRI檢查

大鼠麻醉滿意后，毛巾包裹軀干，充分保暖，放置于MRI掃描床，俯臥位，頭先進。三平面定位掃描（冠狀位，矢狀位，橫斷位各3幅圖像，GRE快速掃描）完成后，進行橫斷面、矢狀面及冠狀面T1WI、T2WI以及橫斷面DTI掃描。掃描參數(shù)：T1WI：自旋回波（SE），TR 2633ms，TE 23.4ms，層厚3.0mm，層間隔0.0mm，翻轉(zhuǎn)角90°；T2WI：快速自旋回波（FSE），TR 4600ms，TE 109.9ms，層厚 3.0mm，層間隔0.0mm，翻轉(zhuǎn)角90°；DTI：單次激發(fā)自旋平面回波序列（SE-EPI），TR 8000ms，TE 109.4ms，層厚3.0mm，層間隔0.0mm，F(xiàn)OV 8cm×8cm，采集矩陣256×256，采集平均次數(shù)NEX 1，b值1000s/mm，采集方向為25。

DTI數(shù)據(jù)處理：MRI掃描完成后將圖像傳送到工作站AW4.3（GE Mdeiacl system，advantage window 4.3），使用Functool軟件進行測量。感興趣區(qū)（ROI）大小為5mm2，置于橫斷面DTI原始圖像腦干部位，為了減少測量時放置ROI受主觀因素影響，采用2位有經(jīng)驗的醫(yī)師測量求平均值。

1.2.4 病理學(xué)檢查

大鼠MRI掃描完畢后，左心腔4%多聚甲醛充分灌注，迅速開顱取全腦。沿矢狀面將大鼠均勻分成6份，去掉最兩邊的2份，取中間部位的4份，置于4%多聚甲醛固定液中后固定24h。組織塊經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋成塊。組織切片烤干后行HE及嗜銀染色及AQP4免疫組化染色。

免疫組化染色圖像分析：應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，測定免疫反應(yīng)產(chǎn)物的累積光密度值（IOD值）。選取大鼠腦干部位，每張切片取5個視野，所得數(shù)據(jù)經(jīng)計算取每組均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。DAI各組均數(shù)分別與對照組行均數(shù)樣本t檢驗，ADC與AQP4表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物行為觀察

Marmarou模型致傷后，出現(xiàn)短時間昏迷，行走不穩(wěn)，呼吸深慢，全身痙攣，四肢抽搐等癥狀，有1只大鼠出現(xiàn)一側(cè)肢體癱瘓。

2.2 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

2.2.1 大體標(biāo)本觀察

所有大鼠均可見頂部頭皮血腫，未見顱骨骨折，腦實質(zhì)表面未見明顯挫裂傷及出血改變。

2.2.2 HE染色觀察

正常對照組大鼠腦干腦組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，染色均勻，血管周圍間隙無增寬；DAI組于各時間點可見大鼠腦干內(nèi)血管腔塌陷，內(nèi)皮皺縮、血管周圍間隙水腫，小血管及毛細(xì)血管破裂出血，部分血管腔閉鎖，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，體積增大，胞漿及核淡染，可見軸索收縮球出現(xiàn)，表現(xiàn)為粉紅色圓形或橢圓形小體（圖2）。

2.2.3 Bielschowsky’s嗜銀染色

對照組：軸索染色均勻，排列規(guī)則，走形自然，無增粗、扭曲，無斷裂。

DAI組：軸索周圍間隙增寬，軸索腫脹、扭曲，可見螺旋狀、串珠狀改變，粗細(xì)不均，部分?jǐn)嗔鸦乜s，可見大量軸索球形成，致傷后3h即出現(xiàn)，隨時間增多，24～72h表現(xiàn)最明顯（圖3）。

2.2.4 AQP4免疫組織化學(xué)染色

對照組：大鼠腦干內(nèi)有AQP4表達(dá)，平均光密度值（IOD）為0.222±0.005，但軸突中未見其積聚表達(dá)。

DAI組：致傷后大鼠腦干AQP4表達(dá)明顯升高（圖4），3h即開始，隨時間變化逐步升高，于24h達(dá)到頂峰，IOD為0.331±0.007，72h有所下降，IOD為0.320±0.004，但仍明顯高于對照組。各時間點IOD與對照組進行均數(shù)t檢驗，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）（表1）。

2.3 磁共振掃描結(jié)果

2.3.1 常規(guī)磁共振掃描結(jié)果

DAI各組T1WI、T2WI橫斷面、矢狀面顯示大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清楚，灰白質(zhì)對比模糊，未見明顯挫裂傷及出血灶，未見蛛網(wǎng)膜下腔出血，顱內(nèi)未見明顯異常信號灶，大鼠頂部頭皮血腫（圖5a，5b）。

2.3.2 DTI掃描結(jié)果

ADC值測量結(jié)果 （圖5c）：對照組大鼠腦干ADC值為0.895±0.121，致傷后3h輕微升高，3～12h升高迅速，于12h達(dá)到頂峰，ADC值為1.584±0.200，隨后下降，72h明顯減低，ADC值為0.660±0.127，低于對照組。DAI組各時間點與對照組進行樣本均數(shù)t檢驗，DAI后6h、12h與對照組之間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05），72h與對照組差別有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

FA值測量結(jié)果（圖5d）：對照組大鼠腦干FA值為0.421±0.006，致傷后FA值持續(xù)下降，于72h達(dá)到最低值，F(xiàn)A值為0.255±0.005。DAI組各時間點與對照組進行樣本均數(shù)t檢驗，各組之間的差別有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.4 AQP4表達(dá)與ADC值、FA值相關(guān)性分析

在12h內(nèi)，AQP4表達(dá)增加（圖6），ADC值升高（圖7），AQP4表達(dá)與ADC值具有顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.691（P<0.01）。12～24h，AQP4表達(dá)先增加并于24h達(dá)到頂峰，ADC值降低，二者沒有相關(guān)性（P> 0.05）。24～72h，AQP4表達(dá)與ADC值均減低，二者具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.608（P<0.05）。AQP4表達(dá)與FA值（圖8）相關(guān)性分析：二者具有顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=-0.946（P<0.01)。

3 討論

Marmaro等用重物打擊大鼠頭部，制造出打擊負(fù)荷DAI模型[2-3]，這種模型設(shè)備簡便、可重復(fù)性較好，本實驗成功復(fù)制了DAI模型，HE染色可見大鼠腦干明顯的水腫改變，嗜銀染色示軸索腫脹、扭曲，大量軸索球清晰可見，在致傷后3h即出現(xiàn)，24～72h達(dá)到高峰。

腦水腫發(fā)病機制與多種因子如水通道蛋白-4、基質(zhì)金屬蛋白酶、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2等有關(guān)，AQPs是構(gòu)成水通道并與水通透有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，可通過調(diào)節(jié)水分子跨膜轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)細(xì)胞外間隙和K+的濃度，AQP4是其一種亞型，在腦內(nèi)含量最多[4]，主要在血－腦和腦脊液－腦的交界面上的星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，對維持腦內(nèi)水平衡起著非常重要的作用。國內(nèi)外許多研究證實腦外傷后AQP4在局部表達(dá)增高和腦水腫密切相關(guān)[1，5]，并且AQP4表達(dá)增高的區(qū)域和腦水腫出現(xiàn)的區(qū)域也一致。Manley等[6]對急性水中毒腦水腫動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，AQP4在水腫模型的腦組織內(nèi)表達(dá)增強，說明AQP4參與了腦水腫的形成，并在其中起重要作用。DAI損傷機制復(fù)雜，特別是繼發(fā)損傷，腦灌注壓不足、腦組織氧代謝障礙、腦內(nèi)過度炎性反應(yīng)、受損腦組織對繼發(fā)性損傷的敏感性增強、腦傷后致傷因子的釋放增加等，導(dǎo)致腦水腫多種類型共存，而且是動態(tài)變化的過程。Stone等[7]研究證實軸索損傷不是外力所引起的原發(fā)性改變，而是由缺氧或腦水腫造成的繼發(fā)性改變，而神經(jīng)軸索損傷的發(fā)展又與腦水腫造成的繼發(fā)性改變有著極為密切的關(guān)系。本實驗顯示彌漫性軸索損傷后腦干部AQP4表達(dá)先升高后降低改變，推測與DAI后腦水腫的類型、程度及時間密切相關(guān)。

表1 對照組及DAI組各時間點大鼠腦干ADC、FA及AQP4表達(dá)情況

DTI利用水分子彌散的各向異性，通過改變彌散敏感梯度方向，在三維空間定量體素內(nèi)水分子在各個方向上的彌散運動。通過測定FA值和ADC值定量分析反應(yīng)腦組織結(jié)構(gòu)完整性和水腫情況，在活體水平無創(chuàng)的觀察DAI后腦水腫及軸索的病理改變。Barzo等[8]應(yīng)用撞擊致大鼠嚴(yán)重DAI模型，進行連續(xù)腦MRI掃描觀察，發(fā)現(xiàn)致傷后40～60min內(nèi)出現(xiàn)ADC值短暫升高，隨后持續(xù)性降低，于7～14d最低值。Schaefer等[9]統(tǒng)計了ADC的變化情況，64%以上的情況下，ADC值表現(xiàn)為降低趨勢。FA主要反映組織結(jié)構(gòu)的完整性，組織結(jié)構(gòu)受到破壞，F(xiàn)A也就相應(yīng)降低。DAI后FA值降低，降低程度與軸索損傷程度密切相關(guān)[10]；在不同的損傷部位及模型中，胼胝體、外囊、小腦角、雙側(cè)額葉、顳葉等[11-15]均可出現(xiàn)FA改變，而且這些改變都表現(xiàn)為降低趨勢。本實驗在DAI傷后3～72h內(nèi)，ADC值出現(xiàn)先增高后降低的改變，而FA值則在致傷后持續(xù)下降，兩者均在72h達(dá)到最低值。與文獻(xiàn)報道基本一致。

那么，大鼠DAI后AQP4表達(dá)與磁共振ADC值、FA值是否存在一定會的相關(guān)性呢，我們進行了相關(guān)研究：研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DAI后12h內(nèi)，ADC值升高，AQP4表達(dá)增加，ADC值與AQP4表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性。分析原因，我們認(rèn)為在損傷后早期由于機械外力的直接損傷等因素，導(dǎo)致血腦屏障破壞，血管源性水腫形成并占據(jù)主要地位，此時細(xì)胞外液增加，腦組織中細(xì)胞外間隙擴大，水分子彌散增加，出現(xiàn)ADC值升高，F(xiàn)A值降低。為了加速血管源性腦水腫的清除，機體出現(xiàn)保護性措施—上調(diào)AQP4含量。

在DAI后12～24h，血管源性繼續(xù)存在，AQP4表達(dá)增加，為清除細(xì)胞間液體，AQP4一方面是通過跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運，使液體重吸收入腦脊液循環(huán)，另一方面，也使部分液體進入細(xì)胞內(nèi)，這也在一定程度上易化了細(xì)胞毒性腦水腫的形成。細(xì)胞毒性腦水腫所占比重開始上升。細(xì)胞毒性腦水腫造成ADC值降低，由于兩者水腫的同時影響，AQP4表達(dá)與ADC值沒有統(tǒng)計學(xué)意義相關(guān)性。

到了24～72h，血管源性水腫消退，上調(diào)AQP4的使動力減弱，此時由于缺血缺氧等繼發(fā)損傷，腦組織以細(xì)胞毒性腦水腫為主，為了減輕AQP4的易化作用，機體下調(diào)AQP4含量。兩因素相繼和持續(xù)作用，AQP4表達(dá)明顯下降。此期ADC值仍下降。

本研究表明：Marmarou自由落體致傷模型導(dǎo)致的大鼠DAI中，AQP4表達(dá)、ADC值及FA值均隨時間變化，聯(lián)合AQP4和ADC值的相關(guān)性，能夠反映大鼠DAI后腦水腫的類型及演變，0～12h內(nèi)以血管源性腦水腫為主，12～24h血管源性腦水腫開始消退，細(xì)胞毒性腦水腫加劇，24～72h以細(xì)胞毒性腦水腫為主。為臨床針對不同類型腦水腫的提供治療依據(jù)。

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