腦星型細胞瘤磁共振波譜與腫瘤細胞的Ki-67、bcl-2相關(guān)性研究

苗 紅，劉文源，宋福林

（1.撫順市中心醫(yī)院影像科，遼寧 撫順 113006；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016）

腦星形細胞瘤是最常見的原發(fā)性顱腦腫瘤，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤不僅存在細胞增殖，同時也存在細胞凋亡受阻，細胞增殖和凋亡的不平衡狀態(tài)是導(dǎo)致腫瘤惡性生長的基礎(chǔ)[1－2]。bcl-2是目前研究較為深入的凋亡抑制基因。Ki-67是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力的代表指標。Ki-67和bcl-2的檢測對判斷星形細胞瘤的惡性程度非常有價值。MR波譜（MR spectroscopy，MRS）是目前唯一無創(chuàng)傷性地研究人體器官、組織代謝、生化改變及化合物定量分析的方法，能在體測量腦組織的各種代謝物。本研究通過對星形細胞瘤1H-MRS的檢測與切除腫瘤標本的Ki-67、bcl-2表達情況分析研究，明確兩者間的關(guān)系，以尋求MRS無創(chuàng)性反映腫瘤惡性程度及預(yù)后的可行性的分子生物學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

52例腦星形細胞瘤MRS檢查結(jié)果與星形細胞瘤標本均來自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院診斷明確病例，時間從2008年6月～2010年9月，其中男28例，女24例，年齡10～77歲，平均38歲。在得到腦星形細胞瘤波譜圖之前，所有患者沒有接受化療和/或放療，沒有腦外傷和/或腦手術(shù)史。52例腦星形細胞瘤按照WHO診斷標準分成兩組：低級別組（25例）、高級別組（27例）。

1.2 MR檢查

使用美國GE 1.5T超導(dǎo)型MRI/MRS掃描系統(tǒng)（Signa，cv/i GE，Milwaukee，Wis.），正交頭線圈進行常規(guī)T1WI和T2WI掃描。掃描參數(shù)：T1WI：TR 300～400ms，TE 10ms；T2WI：TR 3000～4000ms，TE 90～120ms。層厚與層間距1.5mm，F(xiàn)OV 21～24cm，矩陣312×512。T1WI增強的掃描參數(shù)與平掃完全一致，對比劑為釓噴替酸葡甲胺 （Gd-DTPA），注射量0.2mmol/kg。

1H-MRS：在平掃完成后即刻進行波譜掃描或在常規(guī)檢查后2天進行波譜檢查。根據(jù)病灶特點選擇掃描層面即腫瘤最大層面作為MRS定位的層面，感興趣區(qū)（ROI）盡量避開骨骼、脂肪以及含氣結(jié)構(gòu)。采用多體素氫質(zhì)子波譜腦檢查 （PROBE/SI proton brain exam/multiple voxel），點分辨波譜（PRESS）序列對腫瘤區(qū)、對側(cè)正常腦組織區(qū)進行測量，TR 1000ms，TE 144ms，自動勻場，層厚10mm，層距1.5mm，F(xiàn)OV 24×24cm，激發(fā)次數(shù)（NEX）1，相位矩陣160×160，成像時間260s。

星形細胞瘤化合物相對含量分析：將原始數(shù)據(jù)傳入Sun ADW4.0工作站 （Sun Microsystems，Sauta clara，Clif）利用Functool 2000軟件包進行波譜分析，對掃描后波譜進行基線校正，頻率翻轉(zhuǎn)等后處理，獲得腫瘤以及正常對照腦組織的譜線和各種代謝物分布圖（NAA、Cho、Cr、Lac等），并計算出NAA/ Cho、NAA/Cr、Cho/Cr的比值，結(jié)果以±s表示，數(shù)值測量由兩位富有影像診斷經(jīng)驗的醫(yī)師完成。

1.3 試劑和方法

手術(shù)切除獲得所有標本經(jīng)中性4%福爾馬林液固定，石蠟包埋，選擇典型病灶的石蠟塊連續(xù)切片，切片厚2μm，HE染色確定病理診斷。免疫組化試劑A：增強液；試劑B：酶標羊抗鼠/兔聚合物，S-P免疫試劑盒，DAB顯色試劑盒。一抗Ki－67、bcl-2，DAB顯色劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法，按試劑盒說明書進行操作。

1.4 結(jié)果判定

bcl-2陽性反應(yīng)物質(zhì)主要定位在細胞膜或細胞漿。Ki-67陽性反應(yīng)物質(zhì)主要定位細胞核。在組織切片中細胞核或細胞漿呈淡黃色至棕黃色為陽性細胞標志，將陽性細胞數(shù)量及顯色強度分為3級：陽性（+），陽性細胞數(shù)≥25%，強陽性（+++），陽性細胞數(shù)≥75%，中度陽性（++），即陽性細胞及顯色強度介于強陽性和陽性之間。凡顯色強度及背景無明顯差別者為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

將數(shù)據(jù)歸類，利用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件，各組平均值用±s表示，采用χ2檢驗、t檢驗和Spersman等級相關(guān)分析；Pearson Chi-Square檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計意義；P<0.01為有非常顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 1H-MRS結(jié)果

對52例腫瘤實體部分、對側(cè)正常腦組織選擇測量ROI進行波譜分析（圖1～4）。低級別腦星形細胞瘤組、高級別腦星形細胞瘤組和對側(cè)相應(yīng)正常腦組織代謝物的比值結(jié)果見表1。各級別星形細胞瘤的Cho/Cr與NAA/Cho、NAA/Cr與對照正常腦組織相比差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.001），表現(xiàn)為Cho/Cr顯著高于對照腦組織，而NAA/Cho、NAA/Cr明顯變低。高級別腦星形細胞瘤的Cho/Cr高于低級別腦星形細胞瘤和對照組；而NAA/Cho、NAA/Cr則低于低級別腦星形細胞瘤和對照組（圖1～3）。

2.2 免疫組化結(jié)果

Table 1 The ratios of metabolite in astrocytoma and corresponding contralateral normal brain

2.2.1 腦星形細胞瘤中Ki-67標記指數(shù)免疫組化結(jié)果

52例腦星形細胞瘤中 Ki-67陽性表達率為100%（圖4，5）。Ki-67表達量隨病理級別的升高而增高，低級別腦星形細胞瘤（Ⅰ，Ⅱ級）的Ki-67表達量顯著低于高級別腦星形細胞瘤 （Ⅲ，Ⅳ級）（P< 0.01，表2）。腫瘤病理級別（高、低級別）與Ki-67表達量存在正相關(guān)（r=0.625）。

2.2.2 腦星形細胞瘤中bcl-2蛋白的表達

在腦星形細胞瘤組織中有bcl-2蛋白表達，其陽性染色部位定位于細胞質(zhì)內(nèi)，表現(xiàn)為腫瘤細胞質(zhì)呈棕黃色（圖6，7）。不同惡性度的腦星形細胞瘤的bcl-2蛋白表達不同（χ2=9.283，P=0.007），bcl-2在高級別與低級別腦星形細胞瘤的表達有顯著性差異（P<0.001），隨著病理分級的升高，bcl-2表達量逐步上升（表3）。

Table 2 Protein expression of Ki-67 in different grade of astrocytoma

Table 3 Protein expression of bcl-2 in different grade of astrocytoma

2.2.3 Ki-67和bcl-2蛋白表達的關(guān)系

經(jīng)Spersman等級相關(guān)分析，在52例腦星形細胞瘤中Ki-67與bcl-2蛋白表達密切相關(guān)，二者呈明顯正相關(guān)（r=0.712，P<0.01），見表4。

Table 4 Relationship of Ki-67 and bcl-2 in different grades of astrocytoma

2.2.4 MRS與Ki-67、bcl-2的關(guān)系

星形細胞瘤Cho/Cr隨Ki-67表達的升高而升高，呈顯著正相關(guān) （r=0.809，P<0.01）；星形細胞瘤NAA/Cho與Ki-67表達顯著負相關(guān) （r=-0.501，P< 0.01）。星形細胞瘤Cho/Cr隨bcl-2表達的升高而升高，呈顯著正相關(guān) （r=0.736，P<0.01）；星形細胞瘤NAA/Cho與bcl-2表達呈顯著負相關(guān)（r=－0.253，P< 0.01）。星形細胞瘤NAA/Cr與Ki-67表達呈負相關(guān)（r=-0.416，P<0.01）；星形細胞瘤NAA/Cr與bcl-2表達呈負相關(guān)（r=-0.369，P<0.01；表5，6）。

3 討論

腦星形細胞瘤的1H-MRS表現(xiàn)為NAA/Cho比值降低，NAA/Cr比值降低，Cho/Cr比值升高，出現(xiàn)Lac、Lip峰。本結(jié)果顯示，不僅低、高級別腦星形細胞瘤分別和對側(cè)正常腦組織的NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/ Cho比值存在顯著性差異（P<0.01），而且低級別腦星形細胞瘤和高級別腦星形細胞瘤的NAA/Cr、Cho/ Cr、NAA/Cho比值亦存在顯著性差異（P<0.05）。腦星形細胞瘤是由異常增生的星形細胞組成，在生長過程中，腫瘤常侵犯正常神經(jīng)元，從而導(dǎo)致在1H-MRS上NAA明顯降低，Cr輕度下降，Cho顯著增高，因此NAA/Cr、NAA/Cho比值下降，Cho/Cr比值升高，因此利用NAA/Cr、NAA/Cho、Cho/Cr比值可以區(qū)分正常腦組織、低和高級別腦星形細胞瘤，本組與文獻報道也大致相同[3-4]。本研究表明，隨著腫瘤惡性度的升高，NAA/Cho比值更加降低，各級別間具有顯著差異。從表1中可見NAA/Cho低級別腦星形細胞瘤組與高級別腦星形細胞瘤組重疊部分最小，說明NAA/ Cho可以作為腦星形細胞瘤侵襲力與增殖能力的一個綜合指標。本研究顯示，腦星形細胞瘤的NAA/ Cho、Cho/Cr、NAA/Cr比值與病理級別相關(guān)，其中NAA/Cho和Cho/Cr比值反映腫瘤級別比較穩(wěn)定；隨著腫瘤級別的增高，各級別腦星形細胞瘤的NAA/ Cr、NAA/Cho比值存在負相關(guān)（P<0.01）；而各級別腦星形細胞瘤的Cho/Cr比值存在正相關(guān) （P<0.01）。Poptani等[5]利用NAA可完全區(qū)分腫瘤及炎性病變；在病理組織學(xué)分級診斷中，NAA對腫瘤良、惡性鑒別的準確率達到82%，為腦腫瘤分類提供了一種非侵襲性方法。

Table 5 The relationship between the ratios of metabolite in MRS of astrocytoma and the expression of Ki-67

Table 6 The relationship between the ratios of metabolite in MRS of astrocytoma and the expression of bcl-2

Ki-67抗原是存在于增殖細胞核的一種非組蛋白性核蛋白，其表達隨細胞周期不同時相而異，與其他反映細胞增殖的指標如細胞增殖核抗原（PCNA）、DNA聚合酶、溴脫氧嘧啶相比，Ki-67抗原半衰期短，細胞脫離增殖周期后迅速降解，更能反映腫瘤的增殖活性、惡性程度及判斷患者預(yù)后[6-7]。本研究結(jié)果顯示，Ki-67的表達水平與星形細胞瘤的惡性程度呈正相關(guān)，惡性程度較低（Ⅰ、Ⅱ級）的星形細胞瘤與惡性程度較高（Ⅲ、Ⅳ級）的星形細胞瘤之間表達存在顯著性差異（P<0.01），與文獻報道相似[8]，隨著星形細胞瘤惡性程度增加，Ki-67的表達增強。由此可見，Ki-67表達與星形細胞瘤的惡性行為相關(guān)，可作為評價星形細胞瘤細胞增殖狀態(tài)及判斷腫瘤預(yù)后的重要指標。

bcl-2是第一個被確認有抑制凋亡作用的基因，bcl-2阻礙細胞凋亡的機制可能在于bcl-2與凋亡促進基因bax拮抗，抑制細胞色素C自線粒體釋放至胞質(zhì)，阻止胞質(zhì)細胞色素C對caspase蛋白酶的激活，從而抑制凋亡的發(fā)生[9]，隨著腫瘤惡性程度的增加，腫瘤細胞的增殖和凋亡均會增加，只是細胞凋亡增加相對較少，腫瘤組織的增殖活性和凋亡狀態(tài)對判斷腫瘤的惡性程度、生物學(xué)特性具有重要意義。本研究結(jié)果表明，腦星形細胞瘤中Ki-67與bcl-2蛋白表達兩者之間關(guān)系密切 （r=0.712，P< 0.01），bcl-2在各實驗組中的表達隨Ki-67蛋白表達水平的升高而升高，這表明bcl－2亦有可能作為反映腫瘤細胞增殖能力的指標，其促進腫瘤細胞增殖的原因可能與其抑制凋亡有關(guān)。bcl-2與Ki-67聯(lián)合應(yīng)用，在低級別腦星形細胞瘤與高級別腦星形細胞瘤的鑒別診斷中會有一定的意義。

本組腦星形細胞瘤的表現(xiàn)為NAA/Cho明顯降低、NAA/Cr降低、而Cho/Cr明顯升高，NAA/Cho與Ki-67和bcl-2的蛋白表達都是顯著的負相關(guān)，而Cho/Cr與Ki-67和bcl-2的表達都是顯著正相關(guān)。當(dāng)腫瘤細胞的凋亡被抑制、細胞分裂活躍、增殖的腫瘤細胞增多使細胞膜轉(zhuǎn)化增多及腫瘤細胞總數(shù)增多，細胞膜磷脂前體增加，使MRS能檢測到Cho的升高，另一方面快速增殖的腫瘤細胞破壞了正常的神經(jīng)元，使磁共振可測得的NAA降低，因此MRS可在一定程度上反映星形細胞瘤的組織學(xué)及分子生物學(xué)改變。本組病例中并非所有星形細胞瘤的NAA/ Cho、Cho/Cr都與Ki-67和bcl-2的表達一致，個別甚至偏離較多，可能是由于在細胞凋亡抑制和細胞增殖活躍之外還有其他影響因素，對免疫組化指標的檢測可更準確反映其惡性程度、侵襲性和預(yù)后[10-11]，是星形細胞瘤分級診斷的必要補充。

綜上所述，腦星形細胞瘤的MRS（NAA/Cho、 Cho/Cr）比值與Ki-67、bcl-2蛋白表達水平密切相關(guān)，MRS基本上與腫瘤的免疫組化表達相一致，MRS可以無創(chuàng)地在活體上全面評價腫瘤代謝信息，對星形細胞瘤診斷、分級、生物學(xué)特性評估、指導(dǎo)放療、術(shù)前手術(shù)方案制定和判斷預(yù)后提供分子生物學(xué)水平的依據(jù)。

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