禽結(jié)核菌素生產(chǎn)用菌種的制備與鑒定

王楠，辛凌翔，徐磊，程君生，王團(tuán)結(jié)，任小俠，毛開榮，李俊平

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

禽分枝桿菌(Mycobacteriumavium)是鳥分枝桿菌復(fù)合體(MAC)的一種，包括4個(gè)亞種，即禽分枝桿菌禽亞種(M.aviumsubsp.avium，MAA)、人豬型亞種(M.aviumsubsp.hominissuis，MAH)、森林土壤亞種(M.aviumsubsp.silvaticum，MAS)和副結(jié)核亞種(M.aviumsubsp.paratuberculosis，MAP)。這些亞種雖然密切相關(guān)，但每個(gè)亞種都具有不同的致病性、宿主范圍和環(huán)境分布[1-2]。

禽結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)是用于禽結(jié)核菌素試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)制劑，更重要的是禽類PPD也被用作牛皮內(nèi)結(jié)核菌素比較試驗(yàn)，用于感染牛分枝桿菌和其他分枝桿菌的區(qū)分[3]。不同的國(guó)家用于生產(chǎn)禽結(jié)核菌素的菌株各不相同，我國(guó)用CVCC68201、CVCC68202和CVCC68203株制備禽結(jié)核菌素，這3株菌1985年分離自結(jié)核病死雞。生產(chǎn)用種子和制備工藝應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》2000年版的有關(guān)規(guī)定[4]。本研究對(duì)生產(chǎn)禽結(jié)核菌素的種子進(jìn)行了全面鑒定，并制備了提純禽結(jié)核菌素。

1 材料與方法

1.1 菌種

禽分枝桿菌CVCC68201、CVCC68202、CVCC68203,1985年9月1日凍干，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

禽結(jié)核菌素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。配氏培養(yǎng)基、蘇通培養(yǎng)基、普通肉湯，5%牛奶蔗糖溶液均購(gòu)自北京中海生物科技有限公司，抗酸染色試劑盒和基因組提取試劑盒均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF雞(2 kg左右)和SPF豚鼠(300～400 g)均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。本試驗(yàn)經(jīng)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.4 菌種復(fù)壯

無(wú)菌打開菌種，用0.2 mL普通肉湯溶解，劃線接種2支/株配氏試管斜面。置37 ℃培養(yǎng)10 d以上。刮下、稱重、磨碎，加少量生理鹽水稀釋至10 mg/mL，每株菌靜脈注射SPF雞7只(0.2 mL/只)。接種后的15～40 d，無(wú)菌解剖SPF雞，取肝、脾、肺和腸系膜淋巴結(jié)，研磨后取上清液接種配氏培養(yǎng)基試管斜面各2支/株。復(fù)壯后分離的菌株凍干，按常規(guī)方法抽真空封口。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 培養(yǎng)特性鑒定

取新批次凍干的菌種，無(wú)菌開啟安瓿瓶，加入0.2 mL普通肉湯溶解，接種2支/株配氏培養(yǎng)基試管斜面。置37 ℃培養(yǎng)10 d以上，觀察菌落形態(tài)。

1.5.2 形態(tài)和生化特性鑒定

按常規(guī)方法，挑取配氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的單個(gè)結(jié)核菌落進(jìn)行萋爾-尼爾遜(Z-N)抗酸染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

煙酸試驗(yàn)：取培養(yǎng)物1支，加入15 mL熱蒸餾水，浸泡菌落30 min，將浸泡的菌懸液分裝入2支試管中，每管0.4 mL；每管加入3%聯(lián)苯胺乙醇溶液0.2 mL，取其中1管，加入0.2 mL 10%溴化氰水溶液，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

耐熱觸酶試驗(yàn)：吸取0.5 mL 10 mg/mL的菌液于小試管內(nèi)，在68 ℃水浴中孵育20 min，冷卻后加入0.5 mL H2O2和吐溫-80混合液(10%吐溫80加等體積30% H2O2)，觀察氣泡產(chǎn)生情況。

1.5.3 真空度、剩余水分和純粹檢驗(yàn)

根據(jù)《中國(guó)獸藥典》2015年版三部[5]規(guī)定的方法進(jìn)行各項(xiàng)檢驗(yàn)。

1.5.4 PCR測(cè)定

用生理鹽水洗下固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌落，提取3株菌的全基因組DNA，以全基因組 DNA為模板，參考文獻(xiàn)[5]的方法設(shè)計(jì)dnaJ、IS900、IS1245和IS901 4對(duì)引物，參考文獻(xiàn)[6]優(yōu)化的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。禽分枝桿菌各亞種的多重PCR判定標(biāo)準(zhǔn)：多重PCR檢測(cè)的擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)3條目的條帶，即577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)則判為禽分枝桿菌禽亞種/禽分枝桿菌森林土壤亞種；多重PCR檢測(cè)的擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)2條目的條帶，即385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)條帶則判為禽分枝桿菌人豬亞種；多重PCR檢測(cè)的擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)2條目的條帶，即215(IS900基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)條帶則判為禽分枝桿菌副結(jié)核亞種。

表1 合成的引物序列

1.5.5 免疫原性測(cè)定

普通培養(yǎng)基液體表面生長(zhǎng)良好的3株菌培養(yǎng)物，121 ℃高壓滅菌 30 min，用0.4 μm的網(wǎng)紗過(guò)濾，取濾出的上清液，加入40%三氯乙酸混合，使其終濃度為4%。4 ℃靜置，沉淀蛋白，5 000 r/min離心蛋白沉淀，用1 mol/L NaOH溶液溶解蛋白，調(diào)節(jié)pH=7.4，過(guò)濾除菌，即為禽結(jié)核菌素。

制備禽分枝桿菌致敏原，收集過(guò)濾后的菌膜，稱取7 g 于7 mL生理鹽水浸泡過(guò)夜，研碎，加入等體積的弗氏不完全佐劑，反復(fù)抽吸混勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。肌肉注射禽分枝桿菌致敏原0.5 mL/只，用Bradford法測(cè)定禽結(jié)核菌素和禽結(jié)核菌素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白含量，2種菌素稀釋成相同濃度的蛋白含量，再分別作1∶100稀釋后，與禽結(jié)核菌素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，皮內(nèi)注射6只致敏合格的豚鼠，每種結(jié)核菌素各注射2個(gè)點(diǎn)，0.1 mL/點(diǎn)，注射后24 h用游標(biāo)卡尺測(cè)量注射點(diǎn)的紅腫面積。新制備結(jié)核菌素的平均反應(yīng)面積和標(biāo)準(zhǔn)菌素的平均反應(yīng)面積的比值在0.9～1.1之間時(shí)，判定為符合規(guī)定[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性鑒定

禽分枝桿菌CVCC68201、CVCC68202株均從感染的SPF雞脾臟中分離，禽分枝桿菌CVCC68203株從肝臟中分離，上述菌株均常規(guī)凍干。復(fù)蘇凍干后的菌株，配氏培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，肉眼均能觀察到禽分枝桿菌長(zhǎng)出的菌落呈淡黃色、奶油狀(圖1)，菌落黏稠、扁平、薄，挑取菌落時(shí)可成拉絲狀。

圖1 CVCC68201(左)、CVCC68202(中)、CVCC68203(右)生長(zhǎng)狀態(tài)

2.2 形態(tài)和生化特性鑒定

挑取單個(gè)結(jié)核菌落，在載玻片上進(jìn)行萋爾-尼爾遜(Z-N)抗酸染色，染色結(jié)果均為抗酸染色陽(yáng)性，圖2為CVCC68201的抗酸染色結(jié)果，菌體為細(xì)短、直或稍彎的小桿菌。煙酸試驗(yàn)結(jié)果為產(chǎn)生無(wú)色沉淀，未見桃紅色沉淀，煙酸試驗(yàn)陰性；耐熱觸酶試驗(yàn)結(jié)果無(wú)氣泡產(chǎn)生，耐熱觸酶試驗(yàn)為陰性。

圖2 CVCC68201抗酸染色結(jié)果(1 000×)

2.3 真空度、剩余水分和純粹檢驗(yàn)

凍干的 3 株菌種剩余水分測(cè)定結(jié)果均小于4%，符合規(guī)定。真空度測(cè)定結(jié)果均呈現(xiàn)白色、粉色或紫色輝光，將不符合規(guī)定的凍干菌種進(jìn)行無(wú)害化處理。分別各抽取5支真空度測(cè)定良好的3株菌種，用配氏培養(yǎng)基進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，結(jié)果均為純粹生長(zhǎng)(5/5)。

2.4 PCR測(cè)定

由圖3看出，3株菌均能擴(kuò)增出577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)的條帶，結(jié)果表明均為禽亞種/森林土壤亞種。

M. CVCC68201；1. CVCC68201；2. CVCC68202；3. CVCC68203

2.5 免疫原性測(cè)定

用Bradford法測(cè)定禽結(jié)核菌素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(2001)和新制備結(jié)核菌素的蛋白濃度，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為3.6 mg/mL，新制備結(jié)核菌素的濃度為5.1 mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品和新制備結(jié)核菌素均稀釋成1.8 mg/mL后，分別作1∶100稀釋，對(duì)致敏合格的6只豚鼠皮內(nèi)注射，0.1 mL/只。注射結(jié)核菌素24 h后，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)菌素和新制備菌素接種豚鼠的皮膚紅腫面積，結(jié)果見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)菌素(C)與新制備菌素(T)注射豚鼠后的皮膚紅腫情況

計(jì)算平均反應(yīng)面積比值，結(jié)果見表2。新制備菌素與標(biāo)準(zhǔn)菌素的皮膚變態(tài)平均反應(yīng)面積比值為1.07，此結(jié)果符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

表2 標(biāo)準(zhǔn)菌素和新制備菌素注射豚鼠的皮膚紅腫面積

3 討論

禽分枝桿菌被認(rèn)為是“非典型分枝桿菌”，與結(jié)核分枝桿菌不同，禽分枝桿菌是需氧、無(wú)運(yùn)動(dòng)性的桿狀細(xì)菌，其長(zhǎng)度在1～3 μm之間[8]。通過(guò)抗酸(Z-N)染色法可特異性著色。禽分枝桿菌可以在土壤中生存長(zhǎng)達(dá)4年，對(duì)環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力[9-10]。與結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌相比，禽分枝桿菌最適生長(zhǎng)溫度為25～45 ℃。初代分離時(shí)，含有5%～10%的CO2和全卵或蛋黃的培養(yǎng)基可促進(jìn)其生長(zhǎng)[4，10]。通常，禽分枝桿菌在培養(yǎng)后2～4周內(nèi)產(chǎn)生“平滑”菌落，如果培養(yǎng)基中含有甘油，菌落會(huì)更大。光滑透明的菌落對(duì)雞有較強(qiáng)毒力，而具有光滑圓頂或粗糙菌落則無(wú)毒力[11]。本文中分離和鑒定的禽分枝桿菌在含有蛋黃的配氏固體培養(yǎng)基，以及含有大量甘油的液體蘇通培養(yǎng)基中均生長(zhǎng)良好，固體培養(yǎng)為光滑透明的菌落，提示對(duì)雞有較強(qiáng)的毒力，而且在SPF雞體內(nèi)復(fù)壯時(shí)也發(fā)現(xiàn)了典型病變，液體培養(yǎng)后提純的禽結(jié)核菌素在致敏的豚鼠表現(xiàn)出良好的免疫原性。

禽結(jié)核病是一種傳染性疾病，可以感染包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物，家禽的結(jié)核病主要表現(xiàn)為腸道和肝臟疾病，也可擴(kuò)散到肺和脾臟等器官[7，9-12]。禽結(jié)核病潛伏期長(zhǎng)，病程長(zhǎng)，癥狀可持續(xù)數(shù)周或數(shù)月。它在幼禽中的流行率較低，與成年禽相比，病變也較輕，蛋雞感染禽結(jié)核病機(jī)會(huì)較大，損失也較嚴(yán)重。禽分枝桿菌感染的診斷基于臨床癥狀、剖檢病變，病理切片和病變組織的抗酸染色。活禽的出口貿(mào)易中，常通過(guò)皮內(nèi)接種禽結(jié)核菌素進(jìn)行檢疫[4]。陽(yáng)性反應(yīng)被確定為接種部位出現(xiàn)熱性腫脹或直徑約5 mm的小結(jié)節(jié)。結(jié)核菌素試驗(yàn)診斷鳥類感染禽分枝桿菌相對(duì)于臨床病變?cè)\斷法的準(zhǔn)確率大約為80%，但在感染的晚期，鳥類可能沒(méi)有反應(yīng)[10，13]。

自1952年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布第一批結(jié)核菌素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)以來(lái)[14]，結(jié)核菌素為迄今為止診斷結(jié)核病感染的最重要診斷試劑。由于禽分枝桿菌廣泛分布于環(huán)境中，尤其是地表水、土壤和污染的飼料中。張建東等[15]對(duì)我國(guó)牛場(chǎng)中禽分枝桿菌的流行情況進(jìn)行調(diào)查，檢測(cè)到禽分枝桿菌陽(yáng)性率是34.9%，說(shuō)明我國(guó)牛場(chǎng)普遍存在禽分枝桿菌感染。

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)推薦的國(guó)際貿(mào)易中牛結(jié)核病的檢疫方法是結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)。TST是診斷結(jié)核病感染最常用的方法之一，尤其在發(fā)展中國(guó)家，因?yàn)槠涑杀鞠鄬?duì)較低，易于應(yīng)用，且對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施的要求也低。TST方法包括皮內(nèi)注射牛結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)，然后在72 h后測(cè)量注射部位的腫脹(遲發(fā)性超敏反應(yīng))。TST可以單獨(dú)使用牛結(jié)核菌素進(jìn)行試驗(yàn)，也可以使用禽結(jié)核菌素和牛結(jié)核菌素進(jìn)行比較試驗(yàn)。在皮內(nèi)比較試驗(yàn)的解釋中，如果牛結(jié)核菌素注射部位的牛皮膚厚度增加比注射禽結(jié)核菌素的部位不低于4 mm，則通常認(rèn)為TST反應(yīng)陽(yáng)性；如果牛結(jié)核菌素注射部位的牛皮膚厚度增加大于禽類注射部位結(jié)核菌素，且差值小于4 mm，則認(rèn)為TST反應(yīng)不確定；如果牛結(jié)核菌素注射部位皮膚厚度的增加小于或等于禽結(jié)核菌素注射部位，則認(rèn)為TST反應(yīng)陰性[4，15]。

應(yīng)用本文中鑒定的3株禽分枝桿菌制備禽結(jié)核菌素，目的在于區(qū)分動(dòng)物感染的分枝桿菌的種屬是牛分枝桿菌還是禽分枝桿菌，對(duì)于落實(shí)人畜共患的結(jié)核病防控具有非常重要的意義。