豬細(xì)小病毒疫苗研究進(jìn)展

孫海燕，葛 銘

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

豬細(xì)小病毒（PPV）能夠引起母豬繁殖障礙疾病，導(dǎo)致母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母豬不育等。德國學(xué)者M(jìn)ayr在用豬腎原代細(xì)胞進(jìn)行豬瘟病毒組織培養(yǎng)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了PPV，我國學(xué)者潘雪珠等于1983年分離到該病毒，目前該病已呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。

PPV的感染尚無有效的治療方法，疫苗免疫預(yù)防仍是控制該病的主要手段。目前PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、產(chǎn)生抗體時(shí)間長、不需要低溫保存的優(yōu)點(diǎn)；弱毒疫苗免疫效力較強(qiáng)、產(chǎn)生抗體快、用量少、成本低，但安全性較差；基因工程亞單位疫苗免疫源性較好，但成本和技術(shù)要求都比較高；基因工程活病毒載體疫苗可以同時(shí)預(yù)防兩種病或多種病的、能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜、成本較高；基因疫苗生產(chǎn)工藝簡單、免疫劑量小、成本低廉、可構(gòu)建多基因或多價(jià)疫苗，但其安全性受到廣泛關(guān)注[5-7]。

1 弱毒疫苗

弱毒疫苗又稱活疫苗，經(jīng)人工致弱而失去對原宿主的致病力，但仍保持良好的免疫原性的病原體，或用自然弱毒病原體制成的疫苗。弱毒疫苗免疫力較強(qiáng)，產(chǎn)生抗體快，用量少，成本低，但存在毒力返強(qiáng)及散毒的可能，并需要低溫貯運(yùn)。目前的弱毒疫苗主要有NADL-2、HT株、HT-SK-C株和N株，這些弱毒疫苗主要在國外應(yīng)用。最早應(yīng)用于臨床的是NADL-2弱毒株，該毒株是豬細(xì)小病毒強(qiáng)毒株在細(xì)胞上連續(xù)傳50代以上致弱的。該毒株的VP2基因比強(qiáng)毒株NADL-8少300 bp。日本學(xué)者Fujisakl等將豬細(xì)小病毒野毒株在豬腎細(xì)胞上低溫30℃連續(xù)傳54代，產(chǎn)生了HT變異株，該毒株接種豬后能誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體和較強(qiáng)的免疫力，并且不產(chǎn)生病毒血癥，但能誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體和較強(qiáng)的免疫力[8]。杜堅(jiān)等對分離到的一株豬細(xì)小病毒自然弱毒株進(jìn)行免疫接種試驗(yàn)證實(shí)，該弱毒株具有良好的免疫原性和保護(hù)力，并且不產(chǎn)生病毒血癥[9]。盡管已有多株弱毒疫苗在臨床上應(yīng)用，但是由于PPV強(qiáng)毒株的大量存在，人們對病毒重組及弱毒返強(qiáng)的擔(dān)心一直使弱毒疫苗的應(yīng)用受到一定限制。

2 滅活疫苗

我國均普遍使用豬細(xì)小病毒滅活疫苗，使用的主要滅活劑有福爾馬林、β-丙內(nèi)酯（β-PL）、N-乙酰乙烯亞胺（AEI）、二乙烯亞胺（BEI）等。有試驗(yàn)表明，豬細(xì)小病毒用福爾馬林滅活后制成疫苗的保護(hù)效果不如用N-乙酰乙烯亞胺滅活后制成疫苗的保護(hù)效果好；用β-丙內(nèi)酯滅活疫苗的保護(hù)力較好。免疫佐劑也是影響豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效果的重要因素，但幾種佐劑的混合物，如油佐劑、SDS、L-121、氫氧化鋁和油乳劑的混合物以及SDS、氫氧化鋁的混合物作佐劑的疫苗產(chǎn)生的抗體滴度均較低。目前經(jīng)常采用的佐劑是蜂膠、氫氧化鋁和油水乳劑[10]。豬細(xì)小病毒滅活多聯(lián)疫苗的使用較為廣泛，主要有豬細(xì)小病毒-豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒-乙腦病毒等二聯(lián)苗，因?yàn)槌素i細(xì)小病毒外，豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征障礙病毒（PRRSV）、乙腦病毒（JEV）等均能引起母豬的繁殖障礙，而且多聯(lián)苗的使用可以簡化免疫程序，降低臨床應(yīng)激反應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)豬。

3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是將編碼病毒的某種特定蛋白質(zhì)的基因與適當(dāng)質(zhì)粒或病毒載體重組后導(dǎo)入受體（細(xì)菌、酵母或動物細(xì)胞），使其在受體中高效表達(dá)，提取所表達(dá)的特定多肽，加入佐劑制成的一種新型疫苗。其免疫原性較好，但技術(shù)要求高，成本昂貴，難以在臨床上推廣應(yīng)用。盡管豬細(xì)小病毒的弱毒苗和滅活苗在豬細(xì)小病毒的防治中發(fā)揮了十分重要的作用，但是其均存在不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗存在重組和毒力返強(qiáng)的潛在威脅，而滅活苗的免疫效果不穩(wěn)定。因此，研制更為安全有效的疫苗成為豬細(xì)小病毒免疫防制的主題。

4 基因工程亞單位疫苗

基因工程活病毒載體疫苗是利用基因操作技術(shù)，將異原性病毒的保護(hù)性抗原基因及啟動子序列插入到作為載體的另一種病毒（如弱毒疫苗株）的基因組非必需區(qū)中，由于異原病毒基因已成為載體病毒基因組的一部分，可隨載體病毒的繁殖而不停的表達(dá)，因而這種疫苗在機(jī)體可同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對載體病毒及異原性病毒的特異性免疫反應(yīng)[11]?；畈《据d體疫苗與弱毒疫苗相似，能誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的免疫反應(yīng)，而且作為載體的活病毒經(jīng)過改造其安全性較傳統(tǒng)弱毒疫苗大為提高。但其生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜，成本較高，目前仍多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

吳丹將豬細(xì)小病毒VP2基因及豬γ-干擾素（IFN-γ）基因同時(shí)克隆到真核表達(dá)載體中，構(gòu)建了共同表達(dá)VP2和IFN-γ的基因免疫質(zhì)粒，用此表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)或加入脂質(zhì)體肌注接種小鼠，結(jié)果表明，脂質(zhì)體可以加強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒接種小鼠的免疫應(yīng)答水平，為研制豬細(xì)小病毒基因疫苗提供了依據(jù)[12]。呂建強(qiáng)等將豬細(xì)小病毒的VP2基因插入到豬偽狂犬病病毒載體中，有望研制出豬細(xì)小病毒-豬偽狂犬病病毒二聯(lián)重組基因工程苗[13]。

5 核酸疫苗

核酸疫苗又稱基因疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗兩種，目前研究中以DNA疫苗為主。核酸疫苗是含有編碼蛋白基因序列的質(zhì)粒載體，將質(zhì)粒經(jīng)一定途徑導(dǎo)入宿主體內(nèi)，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。DNA疫苗在預(yù)防和治療感染性疾病、變態(tài)反應(yīng)和癌癥等方面有著廣泛的應(yīng)用前景[14]。

與傳統(tǒng)疫苗相比較，核酸疫苗免疫效果更好，DNA疫苗接種機(jī)體后，蛋白抗原是在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其加工遞呈過程都與病毒自然感染十分相似，從而激發(fā)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，DNA疫苗既可以誘導(dǎo)體液免疫又可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，導(dǎo)入宿主體內(nèi)的DNA載體不會受到母源抗體的影響，在許多動物疾病早期預(yù)防中意義重大；產(chǎn)生的免疫應(yīng)答持久，導(dǎo)入的外源基因可以在宿主體內(nèi)存在較長的時(shí)間，不斷地表達(dá)蛋白抗原，能夠持續(xù)地給機(jī)體免疫系統(tǒng)提供刺激，因此能夠使機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答；DNA疫苗可以通過質(zhì)粒攜帶兩個(gè)或多個(gè)抗原基因，從而構(gòu)建多價(jià)疫苗或多聯(lián)疫苗，大大提高疫苗的效果或達(dá)到接種一種疫苗預(yù)防多種疾病的目的；DNA疫苗不會出現(xiàn)弱毒疫苗和活載體疫苗的毒力返祖的危險(xiǎn)；生產(chǎn)簡單、運(yùn)輸方便，DNA疫苗只需構(gòu)建高效表達(dá)的質(zhì)粒，在細(xì)菌中生產(chǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增并純化，省去了傳統(tǒng)疫苗的蛋白表達(dá)提純等繁瑣工作，干燥DNA疫苗在室溫穩(wěn)定性高，不需要冷藏設(shè)備，大大降低了儲存和運(yùn)輸?shù)某杀尽Ｚw俊龍等用豬細(xì)小病毒的VP1和VP2基因分別構(gòu)建了豬細(xì)小病毒的核酸疫苗，結(jié)果表明，這兩種疫苗均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫[15]。

DNA疫苗構(gòu)建過程中目的基因的選定是決定疫苗免疫效果的關(guān)鍵，應(yīng)選擇病原主要的保護(hù)性抗原基因或?qū)⑼徊≡亩喾N保護(hù)性抗原基因同時(shí)克隆入載體中，另外，選擇安全高效的表達(dá)載體質(zhì)粒。不同的免疫途徑對DNA疫苗的免疫效果也有一定的影響，目前采用的主要免疫途徑為肌肉注射。對接種的組織進(jìn)行預(yù)處理可提高外源基因表達(dá)量，增強(qiáng)免疫效果。研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)胞因子的基因插入到疫苗DNA質(zhì)粒中作為遺傳佐劑，可以提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平（例如干擾素基因、轉(zhuǎn)移因子基因、IL-2等）[16]。DNA疫苗的安全性是被廣為關(guān)注的問題，人們擔(dān)心外源基因會整合到宿主的染色體上而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。但迄今為止，研究者們還沒有發(fā)現(xiàn)這樣的整合性。理論上應(yīng)用病毒DNA疫苗的轉(zhuǎn)化作用和轉(zhuǎn)化機(jī)率不會高于病毒的自然感染。由于DNA疫苗在體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)較慢，不適于作為某些病毒的緊急接種。如何提高DNA疫苗的導(dǎo)入效率，也需要進(jìn)行深入的研究[17-18]。

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