豬圓環(huán)病毒檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

苗麗娟

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

豬圓環(huán)病毒（PCV）為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物DNA病毒。該病毒基因組為單股環(huán)狀DNA，無囊膜，粒子呈20面體對(duì)稱，直徑17～20 nm。根據(jù)PCV的抗原性、核苷酸序列及致病性，將PCV分成PCV1和PCV2兩種基因型。PCV1無致病性，PCV2具有致病性。PCV2與近年來在世界各國普遍發(fā)生的PCV感染密切相關(guān)。該病主要以進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征，已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2還可以造成育肥豬皮炎與腎炎綜合征，并與懷孕母豬的繁殖障礙、新生仔豬的先天性震顫、新生仔豬腹瀉病、增生性壞死性肺炎的發(fā)生密切相關(guān)。隨著該病的出現(xiàn)，人們?cè)絹碓街匾晫?duì)豬圓環(huán)病毒的研究[1]。

PCV在臨床癥狀上容易與一些疾病混淆，如豬瘟等。僅通過臨床癥狀、病理剖檢很難做出準(zhǔn)確診斷，因此實(shí)驗(yàn)室診斷方法是PCV的重要診斷方法。診斷PCV的方法大致分成血清學(xué)方法與分子生物學(xué)方法兩類。血清學(xué)診斷方法包括免疫組織化學(xué)檢測(cè)（IHC）、酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）和間接免疫熒光（IFA）等。分子生物學(xué)診斷方法包括PCR、RT－PCR和熒光定量PCR等，是通過檢測(cè)組織病料及病毒培養(yǎng)物中的病毒核酸來判斷的，還可以采用病毒的分離與鑒定的方法。

1 病毒的分離與鑒定

將病死豬組織（肺、淋巴結(jié)等）與PBS 1∶5研磨，凍融3次，8 000 rpm離心15min，取上清。接種于無PCV污染的PK－15細(xì)胞，同時(shí)加入1/10體積的300mmol·L－1D－氨基葡萄糖。通常在病料接種后3 d，通過IFA、PCR或電子顯微鏡觀察等方法確認(rèn)病毒分離情況。病毒分離費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于疾病的快速診斷。

2 血清學(xué)方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附方法

酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）是以抗體抗原反應(yīng)為原理的技術(shù)，是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后產(chǎn)生的一種檢測(cè)抗體或抗原的免疫酶技術(shù)，該技術(shù)簡(jiǎn)單、靈敏、快速。血清學(xué)方法中最主要的是ELISA法，主要包括競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接ELISA、抗原捕獲ELISA等。

2.1.1 競(jìng)爭(zhēng)ELISA

競(jìng)爭(zhēng)ELISA主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原。用特異性抗體致敏固相載體，加入含待測(cè)抗原的樣品及一定量的酶標(biāo)抗原共同培養(yǎng)，洗滌除去標(biāo)記和未標(biāo)記的抗原，加底物顯色。Walker等首次利用PCV1和PCV2特異性單克隆抗體建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA（c－ELISA）方法來檢測(cè)PCV2抗體，并將這種方法和IFA方法相比，檢測(cè)結(jié)果表明，該方法比IFA更敏感，可用于PCV2抗體的大規(guī)模檢測(cè)[2]。

2.1.2 間接ELISA

間接ELISA主要用于測(cè)定抗體。用抗原致敏固相載體，然后加入待測(cè)抗體的血清，培養(yǎng)后洗去未結(jié)合成分，再加入酶標(biāo)抗體，洗滌后加入底物，在酶的催化下底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。Nawagitgul等報(bào)道了兩種間接ELISA法，一種以細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2全病毒作為抗原（PCV2－ELISA），另一種以O(shè)RF2重組桿狀病毒表達(dá)產(chǎn)物作為包被抗原（ORF2－ELISA），分別用于檢測(cè)針對(duì)全病毒和病毒核衣殼蛋白的抗體。試驗(yàn)結(jié)果顯示，ELISA方法敏感性高、重復(fù)性好，并且與PPV及PRRSV的抗體無交叉反應(yīng)[3]。但是，由于PCV2 ELISA不能有效區(qū)分PCV1與PCV2抗體，并且PCV2病毒培養(yǎng)物滴度低，純化困難，因此該方法的應(yīng)用受到很大限制。

2.1.3 抗原捕獲ELISA

有研究人員利用單抗建立了抗原捕獲ELISA方法檢測(cè)PCV2特異抗體。McNeilly等以PCV2特異性單抗為工具建立了抗原捕獲ELISA用于仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的診斷，發(fā)現(xiàn)抗原捕獲ELISA與病毒分離、IHC一樣能很好地鑒別PMWS與PCV2的亞臨床感染[4]?？乖东@ELISA的建立為PMWS與PCV2的亞臨床感染的鑒別診斷提供了很好的手段。

2.2 間接免疫熒光

間接免疫熒光（IFA）主要利用已知抗原來檢測(cè)待檢血清的抗體，用于病毒分離效果的鑒定及病變組織或豬源細(xì)胞PCV感染情況的檢測(cè)。陳慶新等將浙江省杭州地區(qū)28個(gè)豬場(chǎng)采集豬血清1 677份用IFA試驗(yàn)進(jìn)行PCV2的抗體檢測(cè)，檢測(cè)出陽性血清960份，陽性率為55.48%，調(diào)查結(jié)果顯示，杭州地區(qū)豬場(chǎng)為普遍感染[5]。這種方法成本低、簡(jiǎn)單、快速、靈敏，但實(shí)際操作復(fù)雜，因此不適合臨床上的快速診斷。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)（IHC）與IFA一樣，也是一種免疫染色方法，是在抗原抗體特異性反應(yīng)的前提下，利用酶細(xì)胞化學(xué)的手段，檢測(cè)抗原或抗體的一門新技術(shù)。IHC是可以對(duì)攜帶抗原的細(xì)胞及組織的形態(tài)進(jìn)行大體的評(píng)價(jià)，而且在普通顯微鏡下就可以進(jìn)行觀察，且顏色穩(wěn)定，樣本易保存。有學(xué)者應(yīng)用IHC法對(duì)PMWS患病豬的淋巴組織進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)淋巴組織中單核巨噬細(xì)胞內(nèi)和組織細(xì)胞內(nèi)PCV2的陽性信號(hào)很強(qiáng)，說明PCV2主要存在這些細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。

2.4 免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)

免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）是將生長有PCV病毒的PK－15細(xì)胞在96孔板上長成單層后，加入10倍稀釋的待檢豬血清，作用一定時(shí)間后吸干洗滌，再加入HRP標(biāo)記的抗豬IgG，37℃孵育30min，吸干洗滌后加入底物溶液顯色，然后終止反應(yīng)。劉長明等在優(yōu)化此檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，研制出一種新的IPMA抗體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒用于豬血清中PCV－2抗體檢測(cè)，具有特異、敏感、操作簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)[6]。

3 分子生物學(xué)診斷方法

主要應(yīng)用分子生物學(xué)方法來檢測(cè)組織病料或培養(yǎng)物中的病毒核酸。

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種快速、簡(jiǎn)便、特異的診斷方法，可直接檢測(cè)病毒核酸，在獸醫(yī)臨床檢測(cè)病原中廣泛應(yīng)用。經(jīng)過多年研究，已建立了多種形式的PCR方法，主要包括常規(guī)PCR、多重PCR、套式PCR、熒光定量PCR及PCR－RFLP等方法。

3.1.1 常規(guī)PCR

常規(guī)PCR是通過設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，直接從病料或細(xì)胞中擴(kuò)增PCV2特異的基因組片段，以達(dá)到特異檢測(cè)PCV2的目的。Morozov從PCV－PK－15DNA鏈上設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，可直接檢測(cè)組織病料及其細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒核酸。

3.1.2 多重PCR

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，主要是通過在同一反應(yīng)中加入多對(duì)引物從而同時(shí)檢測(cè)2種或2種以上病毒DNA。由于這種方法方便、快捷，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床，給疾病的快速診斷帶來了方便。

3.1.3 套式PCR

套式PCR克服了由于組織病料或細(xì)胞中的PCV2模板DNA含量太少，而不能檢測(cè)到PCV2基因組存在的特點(diǎn)。方法是設(shè)計(jì)兩套引物，先用第1套引物進(jìn)行PCR，然后取少量PCR產(chǎn)物作為模板，用第2套引物即套式引物再進(jìn)行PCR。套式PCR較常規(guī)PCR及復(fù)合PCR更為敏感。

3.1.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR方法具有良好的特異性和重現(xiàn)性，與普通PCR相比，特異性和靈敏度都更高一些，而且能夠有效減少試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的污染，便于觀測(cè)，能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過程。羅玉均等建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)PCV－2[7]。

3.1.5 PCR－RFLP分析方法

PCR－RFLP是指先以PCR快速而有效的擴(kuò)增微量DNA，再利用限制酶進(jìn)行多態(tài)性分析的試驗(yàn)方法。王新等借助RFLP方法對(duì)PK－15細(xì)胞、IBRS－2細(xì)胞以及疑似PMWS、豬皮炎腎炎綜合征（PDNS）的病料進(jìn)行了PCV檢測(cè)以及血清型的鑒定[8]。

3.2 原位雜交

原位雜交（ISH）是利用核酸分子單鏈之間互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的雜交雙鏈。ISH具有敏感性高和精確定位PCV病毒或PCV及PRRSV病毒DNA或RNA在細(xì)胞中的部位的特點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究PCV的致病機(jī)理及與PPV或PRRSV之間的協(xié)同效應(yīng)提供了幫助。肖馳等建立了CSF－PRRS－PCV2診斷DNA芯片，能同時(shí)檢測(cè) PRRS、CSF和PCV－2感染[9]。

4 小結(jié)

目前PCV2和其相關(guān)的疾病已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生和流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。因此，建立一種簡(jiǎn)單、靈敏、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，適合臨床推廣的快速檢測(cè)方法仍是目前研究的主要任務(wù)和方向。雖然目前檢測(cè)PCV的方法很多，但各種方法都有其自身的局限性，因此要根據(jù)試驗(yàn)的目的要求，結(jié)合具備的條件選擇適宜的檢測(cè)方法檢測(cè)PCV，做到早發(fā)現(xiàn)，早治療，力爭(zhēng)從根本上解決該病的防控問題。

[1]郭春艷,葛俊偉,李一經(jīng).豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40（6）:79－84.

[2]Walker IW,Konoby CA,Jewhurst V A,et al.Developmentand application of a competitive enzyme－linked immunosorbent assay for the detection of serum antibodies to porcine circovirus type 2[J].JVet Diagn Invest,2000,12（5）:400－405.

[3]Nawagitgul P,Harms PA,Morozov I,etal.Modified indirect Porcine Circovirus（PCV）type 2－based and recombinant capsid protein（ORF2）－based enzyme－linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV[J].Clincal and Vaccine Immunology,2002,9（2）:33－40.

[4]McNeilly F,McNair I,O′Connor M,et al.Evaluation of a porcine circovirus type 2 specific antigen capture enzyme－linked immunosorbent assay for the diagnosis of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs:Comparison with viius isolution,immunohistochemistry,and the polymerase chain reaction[J].JVet Diagn Invest,2002,14（2）:106－112.

[5]陳慶新,商紹彬,葉菊秀,等.杭州地區(qū)豬Ⅱ型圓環(huán)病毒抗體的血清學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科技,2003,33（7）:26－28.

[6]劉長明,張超范,危艷武,等.豬圓環(huán)病毒2型免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)抗體檢測(cè)試劑盒的研制及應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29（8）:621－624.

[7]羅玉均,張桂紅,陳建紅,等.Taqman探針熒光定量PCR快速檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型[J].中國獸醫(yī)雜志,2007,43（1）:77－79.

[8]王新,郭萬柱,徐志文,等.應(yīng)用PCR－RFLP方法對(duì)四川豬圓環(huán)病毒的檢測(cè)與分型研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2006（6）:77－83.

[9]肖馳,曹三杰,文心田,等.PRRS－CSF－PCV2診斷DNA芯片構(gòu)建研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37（8）:799－803.