體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

阮中寶，楊向軍，陳各才，朱 莉，李 偉，楊 兵，歐陽(yáng)溪，潘少輝

(1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006;2泰州市人民醫(yī)院;3江蘇省北科生物科技有限公司)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，在一定條件下能分化成為各種功能細(xì)胞，可被應(yīng)用于多種疾病的治療［1～3］。5-氮胞苷(5-aza)是胞嘧啶核苷的類(lèi)似物，可引起DNA中某些胞嘧啶的低甲基化，從而參與激活表型特異性基因。2011年6～12月，本研究通過(guò)對(duì)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC MSCs)體外分離、培養(yǎng)，并采用5-aza誘導(dǎo)，旨在研究其在體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1．1 材料 5份臍帶標(biāo)本來(lái)源于泰州市人民醫(yī)院2010年9月份產(chǎn)科足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)胎兒。主要試劑和儀器:DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO，NVF0274);通用型SP Kit廣譜免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒、Anti-cTnI抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);倒置顯微鏡(日本Olympus)。SP-9000:生物素標(biāo)記山羊抗兔、大鼠和豚鼠IgG;SP-9001:生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG;SP-9002:生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 hUC MSCs的分離和培養(yǎng) 取采集24 h內(nèi)的新鮮臍帶至培養(yǎng)平皿中，將臍帶沿結(jié)扎內(nèi)側(cè)剪斷，取中間部分。加入適量的生理鹽水，洗滌臍帶至表面干凈無(wú)血，將臍帶移至另一培養(yǎng)平皿中;將臍帶剪成2～3 cm的小段，沿靜脈血管剪開(kāi)，將靜脈血管壁和動(dòng)脈血管剝離;將華通膠剝離，用組織剪剪碎至1 mm3大小，接種于T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為10 ml含10%FBS的DMEM/F12，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。待細(xì)胞60%融合后，1∶3傳代。傳至3代后，部分細(xì)胞冷凍保存，部分細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1．2．2 hUC MSCs的誘導(dǎo) P3代細(xì)胞常規(guī)消化收集，用PBS清洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml，重新接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁(約10%融合)，培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μmol/L的5-aza培養(yǎng)24 h，吸去含5-aza的培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，改用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)對(duì)照組5-aza的濃度為0 μmol/L，其他操作相同。持續(xù)培養(yǎng)4周，每3 d換液1次。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)的變化，分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1、2、3、4周進(jìn)行拍照。

1．2．3 hUC MSCs免疫組化鑒定 將載有誘導(dǎo)分化4周后的MSC和對(duì)照組MSC的蓋玻片用PBS液輕輕洗滌浸泡5 min，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作;顯微鏡下拍照，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2．1 誘導(dǎo)前后hUC MSCs形態(tài)變化 誘導(dǎo)前為典型的梭形，核/質(zhì)比例高，胞質(zhì)量少而均勻，無(wú)顆粒、細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)，核內(nèi)可見(jiàn)明顯核仁，細(xì)胞呈同心圓或漩渦樣生長(zhǎng);處理24 h后，僅有少量細(xì)胞死亡;誘導(dǎo)后1～2周，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化。細(xì)胞多緊密平行排列生長(zhǎng)，細(xì)胞體積變大，紡錘形細(xì)胞比例下降，多數(shù)細(xì)胞呈桿狀，少部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長(zhǎng)梭形或橢圓形;3～4周，細(xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，細(xì)胞數(shù)量較同期未經(jīng)誘導(dǎo)組明顯減少，相鄰細(xì)胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細(xì)胞核質(zhì)比例明顯降低，胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu)、且多聚集于細(xì)胞核周?chē)蠹s30%左右細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)。對(duì)照組未見(jiàn)肌管狀細(xì)胞出現(xiàn)。

2．2 hUC MSCs免疫組化鑒定結(jié)果 經(jīng)免疫組化試劑鑒定，誘導(dǎo)組細(xì)胞均能著淺褐色，即cTnI表達(dá)為陽(yáng)性，對(duì)照組細(xì)胞未能著色，即cTnI表達(dá)為陰性。

3 討論

最近研究表明，應(yīng)用MSC移植有可能取代受損心肌細(xì)胞并建立新的血管來(lái)改善供血及心功能，從而為心肌梗死的治療開(kāi)辟了一條嶄新途徑。

目前MSC的主要來(lái)源為成人骨髓和胎兒臍帶血，但成人骨髓MSC數(shù)量級(jí)增殖分化潛能隨供者年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且采集需行骨髓穿刺，來(lái)源受到限制［4］。臍帶來(lái)源廣泛，便于取材，對(duì)供者無(wú)不利影響，無(wú)倫理道德問(wèn)題的限制，且細(xì)胞增殖、分化能力較強(qiáng)，適合體外大規(guī)模培養(yǎng)。因此，hUC MSCs有望成為骨髓MSC的理想替代來(lái)源。

目前用于臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)組織主要是臍帶 Wharton膠和臍靜脈［5，6］，獲取方法主要有酶消化法、組織塊法等。本研究初步建立了臍帶Wharton膠組織塊法培養(yǎng)和用5-aza誘導(dǎo)hUC MSCs體外定向分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)體系，5-aza誘導(dǎo)3～4周，相鄰hUC MSCs細(xì)胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，大約30%hUC MSCs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)。肌鈣蛋白是心肌細(xì)胞中的一種調(diào)節(jié)蛋白，參與調(diào)節(jié)收縮蛋白的舒縮活動(dòng)，由3個(gè)亞單位組成，cTnI是其中之一，hUC MSCs經(jīng)5-aza誘導(dǎo)分化后，cTnI免疫組化染色陽(yáng)性，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致，提示分化后的細(xì)胞已經(jīng)合成了心肌所特有的物質(zhì)，表明hUC MSCs在體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，為今后細(xì)胞移植治療心肌梗死提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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