組蛋白去乙?；?與自噬

溫 迪，于秀軍，2，郭艷蘇，2*

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050000;2河北省神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

組蛋白去乙?；?HDACs)的主要功能是去除組蛋白N-末端的賴氨酸殘基乙?；糠?，使染色質(zhì)變得致密，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。但是有些HDACs，例如HDAC6，也能夠影響細(xì)胞內(nèi)非組蛋白的功能。研究顯示，HDAC6參與細(xì)胞內(nèi)自噬的降解過程［1］，自噬是包括人在內(nèi)的真核生物共有的一種高度進(jìn)化保守機(jī)制，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)長(zhǎng)壽命蛋白、損傷的細(xì)胞器以及異常蛋白聚集物的更新和重復(fù)利用。研究HDAC6與自噬的關(guān)系將為神經(jīng)變性疾病的治療提供新的線索。

1 HDAC家族的分類及定位

HDAC是1個(gè)大的酶家族，其成員目前已知有18個(gè)不同的亞型，根據(jù)種系發(fā)生和系列同源性分為4大類:Ⅰ(HDAC 1、2、3和8)、Ⅱ(HDAC 4、5、6、7、9和10)、Ⅲ(SIRT1～SIRT7)和Ⅳ(HDAC11)。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ為經(jīng)典家族，是Zn2+-依賴性的HDAC。Ⅰ類HDACs主要與酵母的轉(zhuǎn)錄因子yRPD3相互作用，在不同的發(fā)育階段、不同的組織和細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，主要定位在細(xì)胞核［2］。Ⅱ類HDACs具有組織和時(shí)期特異性，HDAC6主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而HDAC 4、5、7和9主要穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間，只在部分組織細(xì)胞中表達(dá)。Ⅲ類HDACs屬于Sirtuin家族，是酵母SIR2蛋白在哺乳動(dòng)物中的相似物，它不使哺乳動(dòng)物的組蛋白去乙酰化，不屬于經(jīng)典的HDACs，是NAD+-依賴的去乙?；福?］。

2 HDAC6的分子結(jié)構(gòu)及作用

HDAC6基因定位于X染色體p11.22-23區(qū)帶，約21 923 bp，由位于41～677 bp間的28個(gè)外顯子編碼。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來講，HDAC6含有1 216個(gè)氨基酸，是目前發(fā)現(xiàn)的人類最大的蛋白質(zhì)。HDAC6獨(dú)特地?fù)碛袃蓚€(gè)高度同源的催化區(qū)域:一個(gè)起始于第215位氨基酸，另一個(gè)起始于第610位，而且均含有一個(gè)與泛素結(jié)合的富含半胱氨酸和組氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域。C-末端的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)既能與泛素化的錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合，又能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合。體外去乙?；钚晕稽c(diǎn)主要位于C'端第二催化區(qū)域，即H611A。體內(nèi)HDAC6主要分布于胞質(zhì)、核周結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的生長(zhǎng)前沿區(qū)，與包含p150的動(dòng)力復(fù)合物相互作用。HDAC6在心、肝、腎、腦、胰腺等臟器中高表達(dá)，是一種胞內(nèi)酶，具有泛素結(jié)合功能和去乙酰化酶活性，它與底物［α-微管蛋白、HSP90和cortactin］相互作用并使之去乙?；?。通過這些相互作用，HDAC6調(diào)節(jié)許多重要的生物過程，包括細(xì)胞遷移、微管穩(wěn)定性、胞內(nèi)運(yùn)輸、免疫突觸形成以及錯(cuò)誤折疊蛋白的降解［4］。

3 自噬

自噬能清除細(xì)胞內(nèi)過多或異常的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器，甚至病原微生物，不僅有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，也促進(jìn)氨基酸等的再循環(huán)，為多種生化進(jìn)程提供底物或原料。根據(jù)自噬底物進(jìn)入溶酶體的途徑不同，自噬分為:①巨自噬:細(xì)胞質(zhì)中可溶性蛋白和變性壞死的細(xì)胞器被囊泡樣雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹后，自噬體通過細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體，與之融合成自噬溶酶體進(jìn)行降解;②微自噬:溶酶體膜自身發(fā)生內(nèi)陷，直接將底物攝入溶酶體進(jìn)行降解;③分子伴侶介導(dǎo)的自噬:分子伴侶Hsc-70識(shí)別底物蛋白分子的特定氨基酸序列并與之結(jié)合，形成分子伴侶—底物復(fù)合體，然后與溶酶體相關(guān)膜蛋白2A型受體結(jié)合進(jìn)入溶酶體降解［5］。自噬主要由自噬相關(guān)基因(Atg)編碼的蛋白完成。從低等生物到高等生物，大部分Atg為高度保守性。Atg5和Atg6(beclin1)被證明是巨自噬和微自噬的必要基因標(biāo)志，而溶酶體受體則被認(rèn)為是分子伴侶介導(dǎo)的自噬標(biāo)志。LC3是酵母 Atg8(Aut7/ Apg8)在哺乳動(dòng)物的同系物，可作為自噬體的標(biāo)記蛋白。

基礎(chǔ)的質(zhì)量控制性自噬是不依賴于營(yíng)養(yǎng)的“基本的”自噬，主要功能是通過選擇性地對(duì)蛋白質(zhì)聚集體和損壞的細(xì)胞器(包括線粒體)的處理，加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)量控制，對(duì)蛋白和細(xì)胞器的回收利用很重要。特異性地去除小鼠神經(jīng)元的Atg5和Atg7，導(dǎo)致了泛素陽性的蛋白聚集以及神經(jīng)元的進(jìn)一步丟失，充分闡釋了自噬的這一活性。饑餓和應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬非選擇性地降解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物以及細(xì)胞器，為細(xì)胞提供生存的大分子和能量，促進(jìn)細(xì)胞存活，超出安全范圍則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究顯示，盡管質(zhì)量控制自噬和饑餓誘導(dǎo)的自噬共享依賴于溶酶體降解細(xì)胞質(zhì)組分的共同Atg機(jī)制，但二者在功能、本質(zhì)和底物特異性上是不同的［6］。

4 HDAC6與聚集體的形成

錯(cuò)誤折疊及聚集的蛋白是許多年齡相關(guān)或遺傳性神經(jīng)變性疾病共有的病理學(xué)標(biāo)志，包括阿爾茨海默病、帕金森疾病、肌萎縮側(cè)索硬化和多谷氨酰胺疾病等［7］。錯(cuò)誤折疊蛋白不僅沒有功能，還能夠形成干擾細(xì)胞功能的聚集物。因此，錯(cuò)誤折疊蛋白被嚴(yán)密監(jiān)督、處理以及降解，以防止在細(xì)胞內(nèi)堆積。

通常情況下錯(cuò)誤折疊蛋白被泛素化從而被蛋白酶體降解。當(dāng)?shù)鞍酌阁w活性被抑制時(shí)錯(cuò)誤折疊蛋白聚集形成聚集體，聚集體的形成是細(xì)胞保護(hù)性反應(yīng)的一部分，是清除細(xì)胞內(nèi)毒性的錯(cuò)誤折疊蛋白的關(guān)鍵，通常和神經(jīng)變性疾病中細(xì)胞的死亡相關(guān)。聚集體的形成有兩種功能:將錯(cuò)誤折疊蛋白濃集形成聚集體從細(xì)胞質(zhì)中去除，阻止廣泛的細(xì)胞內(nèi)毒性反應(yīng);通過微管組織中心為靶點(diǎn)的蛋白分解裝置(包括自噬)，有效地降解毒性蛋白。

HDAC6通過去乙?；富钚院头核亟Y(jié)合活性參與聚集體的形成，聚集體分為泛素陽性和泛素陰性，HDAC6通過C-末端鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)選擇性地和泛素陽性的聚集體結(jié)合。HDAC6和動(dòng)力蛋白復(fù)合物的組分p150相關(guān)，通過鄰近第二催化區(qū)域的第65位氨基酸多肽與動(dòng)力蛋白結(jié)合，將泛素陽性的蛋白募集至動(dòng)力蛋白，形成泛素陽性蛋白-HDAC6-動(dòng)力蛋白三聚體，沿著微管轉(zhuǎn)運(yùn)至微管組織中心，中間絲細(xì)胞骨架包繞三聚體形成聚集體［8］。實(shí)驗(yàn)表明，在敲除HDAC6的細(xì)胞中，錯(cuò)誤折疊的蛋白聚集物不能形成聚集體;用MG-132誘導(dǎo)聚集體形成，再引入無催化活性或泛素結(jié)合缺陷的突變體HDAC6，都不能形成聚集體，但是可以在細(xì)胞質(zhì)中形成小的泛素化微團(tuán)聚體，而蛋白聚集物則不能轉(zhuǎn)運(yùn)至微管組織中心被降解［6］。這些結(jié)果說明聚集體的形成需要HDAC6，并且依賴于它的去乙?；富钚院头核亟Y(jié)合活性。

在熱休克反應(yīng)通路中，HDAC6通過泛素結(jié)合活性調(diào)節(jié)HSP90-HSF1復(fù)合物的分離，正常情況下，HSP90維持HSF1處于無活性狀態(tài)。在熱休克途徑或蛋白酶體抑制的情況下，HDAC6的泛素結(jié)合能力將蛋白酶體功能障礙的信號(hào)傳遞給HSP90-HSF1復(fù)合物，誘導(dǎo)HSF1轉(zhuǎn)錄因子的釋放和活化，依次激活應(yīng)答的HSP基因，導(dǎo)致主要的分子伴侶HSP70和HSP27聚集，對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物作出反應(yīng)。HSP降低了錯(cuò)誤折疊蛋白的毒性，增加細(xì)胞內(nèi)分子伴侶的表達(dá)，使蛋白分解或者再折疊轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白酶體被降解［9］。

p97/VCP是AAA ATP酶家族的分子伴侶，與泛素蛋白酶體途徑相關(guān)，具有分離酶活性，可以使HSP90-HSF1復(fù)合物分離。研究顯示p97/VCP是HDAC6的配偶體，HDAC6的泛素結(jié)合活性可以使 HDAC6-p97/VCP復(fù)合物分離［10］。HDAC6和p97/VCP之間的平衡決定了泛素化的蛋白是被降解還是形成聚集體，因?yàn)閜97/VCP促進(jìn)了蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，而HDAC6促進(jìn)了泛素化蛋白聚集形成聚集體。然而，在p97/VCP突變細(xì)胞中聚集體形成受損，提示HDAC6和p97/VCP在聚集體形成中的相互聯(lián)系。p97/VCP參與恢復(fù)活化的HDAC6以及再形成HSP90-HSF1復(fù)合物，可以推測(cè)p97/VCP對(duì)于 HDAC6的重復(fù)利用起著至關(guān)重要作用［11］。

5 HDAC6與聚集體的降解即自噬過程

聚集的蛋白具有細(xì)胞毒性，有效地處理錯(cuò)誤折疊的蛋白對(duì)細(xì)胞活力十分必要，這一過程需要三個(gè)相互聯(lián)系的通路:分子伴侶機(jī)制輔助蛋白折疊;蛋白酶體途徑降解錯(cuò)誤折疊的蛋白;聚集體途徑將毒性蛋白分離以及傳遞給自噬細(xì)胞而清除。蛋白聚集物的堆積通過阻塞蛋白酶體或其他間接的機(jī)制抑制蛋白酶體活性，導(dǎo)致聚集的錯(cuò)誤折疊蛋白進(jìn)一步堆積。事實(shí)上不能降解錯(cuò)誤折疊和聚集的蛋白對(duì)許多神經(jīng)變性疾病的神經(jīng)細(xì)胞死亡起主導(dǎo)因素［12］。

自噬體包含的HDAC6產(chǎn)生信號(hào)募集自噬組分，同時(shí)自噬體外的HDAC6與動(dòng)力蛋白、Atg8和Atg12之間存在相互聯(lián)系。但是HDAC6并不是唯一的調(diào)節(jié)自噬募集的蛋白，最近研究表明，另一種泛素結(jié)合蛋白p62也參與調(diào)節(jié)自噬體向蛋白聚合物的募集反應(yīng)，p62和自噬蛋白LC3結(jié)合，這一過程是不依賴于 HDAC6的［10］。質(zhì)量控制的自噬需要HDAC6，但是在饑餓誘導(dǎo)的自噬中HDAC6卻是可有可無的，這一發(fā)現(xiàn)顯示自噬的調(diào)節(jié)是有差別的。在自噬底物中HDAC6招募并且激活了一個(gè)肌動(dòng)蛋白重塑因子cortactin，HDAC6為泛素化蛋白聚集體補(bǔ)充cortactin，使動(dòng)力蛋白重塑，從而促進(jìn)了融合事件［8］，表明質(zhì)量控制的自噬包括微管依賴的運(yùn)輸和肌動(dòng)蛋白依賴的融合。在兩個(gè)過程中，HDAC6起著重要作用，HDAC6和p62獨(dú)立地識(shí)別并且結(jié)合蛋白聚集體或其他質(zhì)量控制自噬底物的特異泛素成分，它們招募并裝配自噬的必需成分，包括自噬體、溶酶體和肌動(dòng)蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過從底物中濃縮自噬的成分，刺激自噬體和溶酶體的融合，激活質(zhì)量控制的自噬，特異和高效地完成蛋白聚集體和損傷細(xì)胞器的清除。

由于自噬體缺乏內(nèi)在酶活性，因此自噬體與溶酶體的融合對(duì)于有效的自噬是十分關(guān)鍵的。使用pH敏感的mCherry-GFP-LC3報(bào)告基因來檢測(cè)融合效率，結(jié)果表明在正常營(yíng)養(yǎng)條件下有效的自噬體和溶酶體的融合需要HDAC6。為了獲得更多HDAC6直接調(diào)節(jié)自噬體和溶酶體融合的證據(jù)，進(jìn)一步在體外測(cè)定分析它們的融合效率。盡管體外測(cè)定不能夠區(qū)分HDAC6敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFS)自噬體和溶酶體的融合缺陷是否由于對(duì)接、圈合或自身膜融合的不足，但是進(jìn)一步提供了自噬體和溶酶體有效融合需要HDAC6的證據(jù)［6］。

自噬體和溶酶體的融合缺陷預(yù)示著自噬體的聚集。體內(nèi)和體外的融合測(cè)定和形態(tài)測(cè)定分析均支持HDAC6在自噬體和溶酶體的融合中起著重要作用，通過自噬流量分析和p62的聚集測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。在HDAC6敲除的MEFS中，溶酶體融合缺陷導(dǎo)致自噬體集聚。在阿爾茨海默病患者營(yíng)養(yǎng)障礙的軸突和額顳葉癡呆小鼠模型也發(fā)現(xiàn)了相似的異常自噬結(jié)構(gòu)的顯著聚集［6］。研究發(fā)現(xiàn)，敲除HDAC6的小鼠和敲除HDAC6的轉(zhuǎn)基因果蠅均出現(xiàn)泛素陽性的聚集體，產(chǎn)生了自發(fā)的神經(jīng)變性。然而，缺乏HDAC6并不影響自噬的激活，而是使自噬體—溶酶體融合受損。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了自噬體—溶酶體融合缺陷和神經(jīng)變性疾病進(jìn)展的因果關(guān)系。如果這一假說是正確的，使用融合促進(jìn)劑促進(jìn)有效的自噬可能是治療神經(jīng)變性疾病最有效的方法［13］。

6 小結(jié)

HDAC6是一種罕見的去乙?；?，以細(xì)胞質(zhì)定位、泛素結(jié)合能力、對(duì)動(dòng)力蛋白和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架產(chǎn)生影響為特征。此外，HDAC6能促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，故選擇性地抑制HDAC6可以嚴(yán)重地破壞細(xì)胞處理錯(cuò)誤折疊蛋白的能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白“垃圾”迅速積累，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。如果在神經(jīng)變性疾病中，蛋白聚集物的毒性是神經(jīng)元功能障礙以及死亡的基礎(chǔ)，通過增強(qiáng)自噬以清除蛋白聚集物將是這一疾病合理的治療方法。雷帕霉素的抗神經(jīng)變性活性為這一觀點(diǎn)提供了證據(jù)［13］。Nixon等報(bào)道在阿爾茨海默病患者腦組織中，發(fā)現(xiàn)不正常、非成熟的自噬體堆積。據(jù)此推測(cè)患者體內(nèi)自噬體和溶酶體的融合可能受損。同樣，自噬體與溶酶體融合缺陷可能與CHMP2B突變引起的家族性額顳葉癡呆有關(guān)。自噬體和溶酶體融合缺陷在神經(jīng)變性疾病中的普遍性可能為探索有效治療方法提供潛在的靶點(diǎn)，而HDAC6直接調(diào)節(jié)自噬體和溶酶體融合。試想，聯(lián)合應(yīng)用自噬激活劑和融合助催化劑可能會(huì)更有效地清除蛋白聚集物，為神經(jīng)變性疾病提供新的治療方法［6］。

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