高同型半胱氨酸血癥對(duì)雌激素受體α基因甲基化修飾的影響及其與腦梗死發(fā)病的關(guān)系

楊志甫，王麗珍 ，孟祥君，張茂林，席富強(qiáng)

(1包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010;2包頭醫(yī)學(xué)院病理教研室)

腦梗死是腦血管病中最常見者，發(fā)病率占腦血管疾病發(fā)病率的70% ～80%。研究證明，雌激素的血管保護(hù)作用主要是通過與雌激素受體α(ER-α)結(jié)合而介導(dǎo)的［1］。高同型半胱氨酸血癥已被確立為腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［2］，但是有關(guān)其誘發(fā)腦梗死的機(jī)制尚未完全闡明。近年研究顯示，高同型半胱氨酸血癥也可能干擾基因的甲基化修飾進(jìn)而引起某些基因的表達(dá)異常來促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究從臨床整體角度來探討高同型半胱氨酸血癥是否可通過干擾ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾，引起基因表達(dá)改變來促進(jìn)腦梗死的發(fā)生發(fā)展，從而為腦梗死的預(yù)防和治療提供新的思路和啟示。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年9月～2011年2月在本院住院的腦梗死患者106例(腦梗死組)，均符合第四屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)CT或MRI檢查證實(shí)。男69例、女37例，年齡41～84(63.54±11.36)歲。排除意識(shí)障礙或存在嚴(yán)重合并癥而不能完成檢查及神經(jīng)功能評(píng)定的患者、心源性腦栓塞患者、存在嚴(yán)重肝病或感染者、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良或合并有免疫性疾病者。47例健康對(duì)照(對(duì)照組)來源于我院體檢科，其中男30例、女17例，年齡39～82(60.06±11.67)歲。兩組年齡、性別有可比性。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè) 抽取受試者清晨空腹肘靜脈血2 ml，抽提基因組DNA按照TIANGEN公司試劑盒提供的方法進(jìn)行。然后進(jìn)行基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾及純化，按照Promega公司A7280 DNA純化試劑盒提供的方法進(jìn)行，純化后的DNA置－20℃保存?zhèn)溆?。參考智艷芳等［3］方法，針對(duì)ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)及第一外顯子區(qū)CpG島的序列完全甲基化和完全非甲基化兩種情況，使用primers設(shè)計(jì)出ER-α基因甲基化特異性引物(ER-pM)和非甲基化特異性引物(ER-pU)。還需在ER-pM、ER-pU的外側(cè)選擇不含CG的區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)外圍引物，將修飾后的DNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增后再分別用ER-pM和ER-pM進(jìn)行第二次擴(kuò)增。引物由Invitrogen公司上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

巢式甲基化特異性PCR引物序列:巢式外圍引物 ER-PN:上游:5'-GAGGTGTATTTGGATAGTAG-3'，下游:5'-AACTCCCTAAACTCTCCCTT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度422 bp。ER-α甲基化引物:上游:5'-CGTCGTGTATAATTATTTCGAGGGC-3'，下游:5'-CTCGCGCACCGTATAACCGATAAAC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度 283 bp;ER-α非甲基化引物:上游:5'-TGTTGTGTATAATTATTTTGAGGGT-3'，下游:5'-CTCACACACCATATAACCACTAAAC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度 283 bp。反應(yīng)體系:12.5 μl，第一輪使用外圍引物ER-PN進(jìn)行擴(kuò)增，其中含有經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾的 DNA 2 μl、Taq 酶0.5 μl、反應(yīng)液10 μl，第二輪分別使用ER-pM和ER-pU進(jìn)行擴(kuò)增，模板為第一輪擴(kuò)增后產(chǎn)物 2 μl、Taq 酶0.5 μl、反應(yīng)液10 μl。反應(yīng)條件:應(yīng)用 Touchdown-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，第一輪PCR:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸lmin，以后每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃，經(jīng)20個(gè)循環(huán)后退火溫度降至45℃;94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸 lmin，20個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。以第一輪PCR產(chǎn)物2 μl為模板，分別使用ER-pM和ER-pU進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，同樣用 Touchdown-PCR，條件同第一輪。取 6 μl PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.2.2 同型半胱氨酸(tHcy)的檢測(cè) 采用熒光生化法檢測(cè)血tHcy濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，正態(tài)分布計(jì)量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采取Spearman秩相關(guān)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死患者血Hcy濃度與ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的相關(guān)性 腦梗死組tHcy濃度為(16.18 ± 6.06)μmol/L，對(duì)照組為(9.61 ± 3.12)μmol/L，前者明顯高于后者(t=7.019，P=0.00)。在腦梗死組，ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)生甲基化的腦梗死患者38例 tHcy濃度為(12.14±3.48)μmol/L，46例半甲基化的腦梗死患者為(15.86±3.56)μmol/L，22例全甲基化的腦梗死患者為(23.83±6.65)μmol/L。將腦梗死患者ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和tHcy濃度進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示，兩者呈高度正相關(guān)(r=0.733，P=0.00)。

2.2 兩組ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的比較腦梗死組有68例發(fā)生了甲基化，其中完全甲基化22例、半甲基化46例，甲基化率為64.2%;對(duì)照組有10例發(fā)生了甲基化，其中完全甲基化3例、半甲基化7例，甲基化率為21.3%。腦梗死組甲基化發(fā)生率顯著高于對(duì)照組(χ2=22.27，P=0.00)。

3 討論

腦梗死是腦血管病中最常見者，探討腦梗死的發(fā)病機(jī)理，制定有效預(yù)防及治療措施是當(dāng)今醫(yī)生和學(xué)者的重要任務(wù)。Leno等研究發(fā)現(xiàn)，女性卒中危險(xiǎn)性低于男性，但在絕經(jīng)后幾年這種差異消失。Dubal等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，雌性動(dòng)物缺血后腦損害較雄性動(dòng)物輕，這種現(xiàn)象隨雌性動(dòng)物衰老和內(nèi)源性卵巢激素的去除而消失。這些研究均提示雌激素有腦保護(hù)作用。而雌激素的腦血管保護(hù)作用是通過雌激素進(jìn)入細(xì)胞后與受體結(jié)合，形成激素—受體復(fù)合物，再進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)功能不同的蛋白質(zhì)合成來發(fā)揮的。與雌激素結(jié)合的受體包括ER-α和ER-β兩種，體外實(shí)驗(yàn)已證明雌激素的血管保護(hù)作用主要是通過與ER-α 結(jié)合介導(dǎo)的［4］。

Hcy作為一種非蛋白質(zhì)組成氨基酸，系各種轉(zhuǎn)甲基代謝(包括DNA的甲基化修飾)的甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。既然Hcy是甲硫氨酸循環(huán)的重要一環(huán)，其異常升高則很可能影響DNA的甲基化過程，并進(jìn)而影響某些基因的表達(dá)而促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。大量研究表明，高同型半胱氨酸血癥是腦卒中發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。它是否會(huì)導(dǎo)致包括ER-α基因在內(nèi)的很多功能基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化修飾，從而使基因表達(dá)沉默，進(jìn)一步導(dǎo)致腦梗死，本文進(jìn)行了相關(guān)探討。

本研究結(jié)果顯示，腦梗死患者ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯高于對(duì)照組，且腦梗死患者ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和tHcy濃度呈高度正相關(guān)，提示高同型半胱氨酸血癥可能通過對(duì)ER-α基因表達(dá)調(diào)控區(qū)的甲基化修飾而降低雌激素的腦保護(hù)作用，從而導(dǎo)致腦梗死發(fā)病，這可能是高同型半胱氨酸血癥作為腦梗死獨(dú)立危險(xiǎn)因素的又一機(jī)制。對(duì)于雌激素水平正常的絕經(jīng)期前的女性腦梗死患者，是否ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化致雌激素表達(dá)下降更有意義，有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］Babilcer FA，De Windt LJ，Van EM，et al.Estrogenic hormone action in the heart:regulatory network and function［J］.Cardiovasc Res，2002，53(3):709-719

［2］Coll BMM，Malionow MR，Beamer N，et al.Hyper homocysteinemia as a risk factor for occlusive vascular disease［J］.Stroke，1990，21(3):572-576.

［3］智艷芳，黃彥生，李著華，等.動(dòng)脈粥樣硬化病人雌激素受體α基因甲基化與高同型半胱氨酸血癥關(guān)系的研究［J］.衛(wèi)生研究，2008，37(3):314-317.

［4］Huang YS，Peng KJ，Wang SR，et al.Different effects of homocysteine and oxidized low density lipoprotein on methylation status in the promoter region of the estrogen receptor gene［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2007，39(1):19-26.