分子生物學(xué)技術(shù)在動物營養(yǎng)學(xué)中的研究現(xiàn)狀與展望

王濤 （山東省膠南市張家樓鎮(zhèn)青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司繁育中心 266406)

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分子生物學(xué)技術(shù)在動物營養(yǎng)學(xué)中的研究現(xiàn)狀與展望

王濤 （山東省膠南市張家樓鎮(zhèn)青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司繁育中心 266406)

隨著動物營養(yǎng)學(xué)的不斷發(fā)展，動物營養(yǎng)學(xué)在現(xiàn)有的條件下在生產(chǎn)性能等方面的提升空間已近很小，所以急需一種新的技術(shù)來改變這一現(xiàn)狀，來實現(xiàn)動物營養(yǎng)學(xué)的再次飛越。分子生物學(xué)的產(chǎn)生是動物營養(yǎng)學(xué)突破這一現(xiàn)狀成為了可能?；蚩寺?、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因工程的出現(xiàn)將分子生物學(xué)技術(shù)在生物學(xué)的研究推向分子水平，分子生物學(xué)技術(shù)已成為研究和揭示生命現(xiàn)象本質(zhì)和規(guī)律的一種重要工具。動物機體的生理病理變化，如生長發(fā)育、新陳代謝、遺傳變異、免疫與疾病等，從本質(zhì)來說，都是基因的表達(dá)、調(diào)控發(fā)生改變的結(jié)果。許多生命現(xiàn)象最終需要在分子水平上解釋闡明。所以，動物營養(yǎng)學(xué)的研究應(yīng)用與分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是與基因工程技術(shù)相結(jié)合，使人們研究營養(yǎng)素對機體的作用機制、動物機體的生理病理變化等問題從機體水平上轉(zhuǎn)移到分子水平上來，這是動物營養(yǎng)學(xué)今后的發(fā)展趨勢之一。因此，及時全面地了解分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展對指導(dǎo)動物營養(yǎng)學(xué)的研究有特別重要的意義[1,3]。

1　營養(yǎng)與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系

所謂基因表達(dá)是指按基因組中特定的結(jié)構(gòu)基因上所攜帶的遺傳信息，經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯等步驟指導(dǎo)合成具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)過程。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多與代謝有關(guān)的動物基因被克隆和鑒定，人們對營養(yǎng)與基因調(diào)控的關(guān)系越來越感興趣。營養(yǎng)與動物基因表達(dá)調(diào)控的研究已成為當(dāng)今動物營養(yǎng)學(xué)研究的一個熱點領(lǐng)域。AUSTIN等描述了營養(yǎng)與基因表達(dá)的關(guān)系是營養(yǎng)素攝入影響DNA復(fù)制和改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，二者又共同調(diào)控基因表達(dá)，即調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、翻譯，決定基因產(chǎn)物，從而維持細(xì)胞分化、適應(yīng)與生長。研究表明,主要的營養(yǎng)物質(zhì)如糖、脂肪酸、氨基酸以及一些微量元素對動物體內(nèi)許多基因的表達(dá)都有影響[3]。

1.1 日糧碳水化合物對磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因表達(dá)的調(diào)控 運用現(xiàn)代分子生物學(xué)的手段和方法已能夠確定日糧中的某些營養(yǎng)物質(zhì)與基因的表達(dá)之間存在著密切的聯(lián)系。目前研究較清楚的是日糧中糖含量對磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因表達(dá)的調(diào)控。PEPCK是動物肝和腎中糖異生作用的關(guān)鍵酶。當(dāng)動物進(jìn)食含有大量糖類的飼料時，PEPCK的啟動子就會關(guān)閉，肝中 PEPCK水平大幅度下降；反之，PEPCK的啟動子就會處于打開狀態(tài)，肝中PEPCK水平得到大幅度提高?？梢?，營養(yǎng)成分對PEPCK的調(diào)控主要通過與啟動子作用而實現(xiàn)的[4]。研究發(fā)現(xiàn)，這種酶的啟動子在基因轉(zhuǎn)錄的啟動部位(500bp范圍內(nèi))包含有多種調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點，它們在代謝信號對基因作用時有重要意義。PEPCK基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)取決于胰島素和cAMP的相對水平，而這又與糖的攝取有關(guān)[4]。所以，當(dāng)進(jìn)食含大量糖類的飼料時，由于cAMP水平的急劇下降以及胰島素水平的急劇上升，從而抑制PEPCK基因的表達(dá)，導(dǎo)致肝中PEPCK水平大幅度下降；而當(dāng)禁食或飼喂高蛋白低糖的飼料時，則情況相反。

1.2營養(yǎng)對脂肪酸合成酶(FAS)基因表達(dá)的調(diào)控 FAS是脂肪酸合成的主要限制酶，存在于脂肪、肝臟等組織中，在動物體內(nèi)起催化丙二酰CoA連續(xù)縮合成長鏈脂肪酸的反應(yīng)，其活性高低直接控制著體內(nèi)脂肪合成的強弱,從而影響整個機體中脂肪的含量[6]。有關(guān)營養(yǎng)與FAS基因的表達(dá)調(diào)控，HESKETS等報道，糖類能誘導(dǎo)FAS基因的轉(zhuǎn)錄，而脂肪則抑制這種誘導(dǎo)的表達(dá)。研究表明，當(dāng)給禁食后的成年鼠飼喂高糖低脂肪的飼料時，F(xiàn)AS基因的表達(dá)增強，而且相應(yīng)的mRNA含量的增加幅度與碳水化合物的攝入量成正比[6]。（1）糖類對FAS基因表達(dá)的影響：研究表明,葡萄糖對FAS基因的表達(dá)調(diào)控可以通過與胰島素的協(xié)同作用而得到顯著提高。加入葡萄糖和胰島素的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)組織中，F(xiàn)AS mRNA水平比對照組提高了28%，單獨添加葡萄糖比對照組提高了7%，而單獨添加胰島素則沒有效果。RHOADS等發(fā)現(xiàn)，3-O-甲基葡萄糖不能激發(fā)FAS基因的表達(dá)，而6-磷酸-2-脫氧葡萄糖在脂肪組織中有類似葡萄糖的作用，能激發(fā)FAS基因的表達(dá)，這說明葡萄糖必須通過中間代謝環(huán)節(jié)才能對FAS基因的表達(dá)調(diào)控起作用[7]。試驗表明，在成年大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)物中6-磷酸-2-脫氧葡萄糖水平與FASmRNA含量呈正相關(guān)。因此，6-磷酸-2-脫氧葡萄糖極有可能是參與FAS基因表達(dá)的重要中間代謝物[5]。（2）日糧脂肪酸對FAS基因表達(dá)的影響：大量研究表明，日糧脂肪酸對FAS基因表達(dá)具有抑制作用，特別是日糧多不飽和脂肪酸(PUFA)(n-3)系可以抑制肝臟中脂肪合成，降低脂肪酸以甘油三酯形式的沉積。Clarke等(1990)用飽和脂肪酸（軟脂酸）、單不飽和脂肪酸（三油酸甘油酯，n-9）、雙不飽和脂肪酸(紅花油,n-6)和PUFA(魚油n-3)喂大鼠。結(jié)果表明，日糧中PUFA降低了肝臟中FASmRNA75%~90%，飼喂紅花油大鼠肝臟中的FASm RNA豐度是魚油的2倍，說明n-3脂肪酸對FAS基因轉(zhuǎn)錄的抑制比n-6脂肪酸有效。而軟脂酸甘油酯和三油酸甘油酯對FASmRNA無影響[8,13,14,20]。（3）蛋白質(zhì)對FAS基因表達(dá)的影響：BONNET的研究結(jié)果表明,高蛋白飼糧抑制豬脂肪組織中FAS基因的表達(dá),脂肪組織中FASmRNA的含量顯著下降:用蛋白質(zhì)含量分別為14%,18%,24%的日糧飼喂60~ 110kg的肥育豬,其脂肪組織中FAS mRNA的含量分別下降了8.14%，11.73%和48.20。由此可見，日糧蛋白質(zhì)可以影響脂肪組織中FAS基因的表達(dá)，但具體的調(diào)控機理目前還不清楚。

1.3營養(yǎng)對瘦素(Leptin)基因表達(dá)的影響 Leptin是脂肪細(xì)胞分泌的一種調(diào)節(jié)體脂沉積的重要因子，是由146個氨基酸殘基組成的非糖基化多肽。Leptin是由肥胖基因(ob基因)編碼的，其表達(dá)具有組織特異性，表達(dá)部位主要在脂肪組織。動物試驗和臨床研究表明：重組人瘦素可用于肥胖癥和Ⅱ型糖尿病的治療；在動物遺傳育種方面，利用瘦素有望提高家畜瘦肉率及繁殖性能。研究表明，禁食和長鏈脂肪酸可顯著降低Leptin基因表達(dá)，重新進(jìn)食后，又可恢復(fù)正常的表達(dá)；高脂肪食物可增加其表達(dá)和血漿leptin水平，腫瘤壞死因子α(TNF-α)可直接作用于脂肪細(xì)胞調(diào)節(jié)leptin的釋放，胰島素和皮質(zhì)酮可增加嚙齒類和人類脂肪細(xì)胞中Leptin水平，鉻可顯著降低瘦素水平，抑制Leptin基因的表達(dá)[10,18]。

1.4 其它營養(yǎng)素對基因表達(dá)的調(diào)控 有研究表明，日糧中Zn缺乏降低了Leptin基因的表達(dá)；日糧中Cu缺乏導(dǎo)致肝臟FAS基因轉(zhuǎn)錄速度加快；日糧添加Cr可以調(diào)節(jié)葡萄糖乳酸循環(huán)和生長激素有關(guān)基因的表達(dá)，達(dá)到增加奶產(chǎn)和提高胴體品質(zhì)的目的；Fe通過控制mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過程，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白的水平。某些氨基酸、維生素等均可調(diào)控有關(guān)基因的表達(dá)。Met對奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白as1基因的表達(dá)有影響[22]。維生素也會對基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，如生物素對氨基酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因的表達(dá)有重要作用。脂溶性維生素主要是對在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控[12]。

2　分子生物學(xué)技術(shù)在動物營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

2.1 基因重組技術(shù) 基因重組技術(shù)是將基因重新組合，使其在受體細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)，是改良生物性狀的有力手段。瘦肉率是動物營養(yǎng)學(xué)家和動物遺傳學(xué)家最為關(guān)注的問題之一，也是肌肉品質(zhì)最為重要的指標(biāo)之一。肌生成抑制素是骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子，主要在骨骼肌中表達(dá)。其活性的喪失會引起動物肌肉的過度發(fā)育。肌纖維直徑變大或纖維數(shù)增加，表現(xiàn)為雙肌性狀。利用基因工程技術(shù)可以篩選肌生成抑制素的抗體或抑制劑，使其與肌生成抑制素結(jié)合，滅活其功能；或者篩選能與肌生成抑制素受體結(jié)合的物質(zhì)，拮抗肌生成抑制素的功能；還可以用突變的基因與正常動物的基因進(jìn)行同源重組，獲得肌生成抑制素基因缺失動物，從而提高動物的瘦肉率[9]。

植酸酶作為一種單胃動物的飼料添加劑，其飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到廣泛的確認(rèn)，它能有效的將植酸結(jié)合的磷有效的釋放從而提高機體對磷的利用率，減少磷在動物糞便中的排出量，降低了環(huán)境的污染。隨著飼料工業(yè)的發(fā)展和分子生物學(xué)的興起，植酸酶的分子生物學(xué)研究，已成為世界性的研究熱點之一。目前的研究主要集中在2個方面：一是植酸酶難以大量生產(chǎn)及生產(chǎn)成本過高。通過基因工程技術(shù)，利用生物反應(yīng)器可有望成百上千倍地提高其表達(dá)量，而且反芻動物本身瘤胃微生物能合成植酸酶，利用此技術(shù)可以尋找出合成植酸酶的方法，從而得到大量的植酸酶；二是天然植酸酶的一些酶學(xué)性質(zhì)(耐溫性、pH適性、催化活性等)與飼料加工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的要求不一致。目前，已從嗜溫微生物中發(fā)現(xiàn)多種高溫植酸酶，利用基因工程技術(shù)在分子水平上對植酸酶基因進(jìn)行改造，可以生產(chǎn)出既耐高溫又具有高酶活性的植酸酶品種，從而提高其在飼料中使用的有效性[1,2,11,12]。

2.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，它是生命科學(xué)中發(fā)展最快的分支之一。隨著植酸酶的研究成為熱點，轉(zhuǎn)植酸酶基因豬的研究也成為人們關(guān)注的焦點，此研究直接達(dá)到了在不降低環(huán)境質(zhì)量的前提下，對養(yǎng)殖業(yè)解決磷污染提供了新的技術(shù)[21]。

轉(zhuǎn)植酸酶基因豬就是將小腸中非致病區(qū)的大腸桿菌植酸酶基因與老鼠腮腺、舌下腺、頜下腺中負(fù)責(zé)合成唾液蛋白質(zhì)的一小部分基因連接起來，將這個基因轉(zhuǎn)入受精的胚胎中，然后將胚胎移植到待孕母豬體內(nèi)，產(chǎn)生具有攜帶植酸酶基因的仔豬。利用DNA分析技術(shù)檢測后代中是否具有轉(zhuǎn)入的植酸酶基因。由于引物具有高度的特異性，所以植酸酶主要在唾液腺中分泌。研究表明，用含有53%植酸磷的大豆作為唯一的磷源配制日糧，飼喂具有中等唾液植酸酶含量的轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行檢測，結(jié)果轉(zhuǎn)基因斷奶仔豬、生長育肥豬磷的真消化率為87.9%、98.8%，而非轉(zhuǎn)基因的仔豬、生長育肥豬的磷真消化率為45.8%、51.9%。差異極為顯著(P<0.01)，且糞中磷的含量下降75%、56%[21]。

2.3 改變動物體內(nèi)的代謝途徑 應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)改變動物的代謝途徑是指在動物體內(nèi)導(dǎo)入新的代謝途徑，采用外來基因，加工后用于動物的表達(dá)。如半胱氨酸是羊毛合成的限制性氨基酸，由于半胱氨酸在羊瘤胃內(nèi)降解，飼料中添加半胱氨酸并不能提高其在血清中的水平。如果羊自身能合成半胱氨酸，將會提高羊毛產(chǎn)量。Ward等(1991)將大腸桿菌中編碼絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酰絲氨酸硫氫化酶基因和MT啟動子連接，并在3’端裝上GH基因的序列，然后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將這一構(gòu)件導(dǎo)入羊體內(nèi)，得到的轉(zhuǎn)基因羊胃上皮細(xì)胞能利用胃中的硫化氫合成半胱氨酸。應(yīng)用生物技術(shù)調(diào)控代謝還可通過對動物腸道微生物進(jìn)行改造，賦予細(xì)菌以新的代謝能力。目前，國外已在進(jìn)行將白蟻中編碼分解木質(zhì)素的有關(guān)酶基因克隆并轉(zhuǎn)移給瘤胃微生物的工作，將大幅度提高反芻動物對秸桿類飼料的利用效率[14,15]。

2.4基因芯片 DNA芯片或cDNA芯片，又稱為基因芯片或微陣列，是一種基因探針。由于DNA芯片技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、多樣性、微型化和自動化等傳統(tǒng)營養(yǎng)學(xué)研究方法無法比擬的優(yōu)點，其在營養(yǎng)學(xué)研究中潛在的應(yīng)用前景十分廣闊。（1）尋找營養(yǎng)相關(guān)新基因，獲取新基因是DNA芯片技術(shù)最主要的應(yīng)用之一。利用DNA芯片技術(shù)，從芯片制備、雜交到信號掃描分析整個過程，一般只需要一周左右的時間。而且DNA芯片技術(shù)可以進(jìn)行生物信息處理，確定基因表達(dá)譜，被檢測目標(biāo)DNA密度高，便于大量篩選新基因，大大提高了發(fā)現(xiàn)新基因的效率。（2）營養(yǎng)相關(guān)基因功能研究。DNA芯片可迅速將腫瘤、糖尿病等眾多疾病基因與營養(yǎng)素聯(lián)系起來，縮短實驗周期，大大加快這些基因功能的確定，從而為揭示這些疾病的分子機制提供可能[16]。(3)營養(yǎng)相關(guān)疾病診斷。DNA芯片可以快速地檢測基因突變，從正?；蚪M中分離出DNA并與DNA芯片進(jìn)行雜交，即可獲得標(biāo)準(zhǔn)圖譜，從病變組中分離出DNA并與DNA芯片進(jìn)行雜交，即可獲得病變圖譜，通過對這2種圖譜的比較、分析，就可以得到病變的DNA信息[17]。因此，利用DNA芯片技術(shù)監(jiān)測動物中營養(yǎng)相關(guān)基因的差異表達(dá)，將會成為預(yù)防和治療營養(yǎng)相關(guān)疾病的重要手段。

3 展望

綜上所述，以基因工程為核心的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于動物營養(yǎng)學(xué)研究領(lǐng)域，具有很大的潛力，它不僅為動物營養(yǎng)學(xué)研究提供了一套全新的技術(shù)和方法，而且可以在基因水平上解決許多營養(yǎng)學(xué)問題，還可在基因水平上解決許多動物機體生理病理變化、營養(yǎng)素的代謝調(diào)節(jié)機制及其與機體的相互關(guān)系等問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和不斷完善，抗生素替代品的生產(chǎn)，動物新品種出現(xiàn)，生理活性物質(zhì)的大量生產(chǎn)都將成為現(xiàn)實。無可置疑，以基因工程為主導(dǎo)的分子生物學(xué)技術(shù)將為畜牧業(yè)的發(fā)展開辟廣闊的前景，具有重要的技術(shù)意義和經(jīng)濟意義。

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