蜜蜂傳染性疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

任 勤，戴榮國(guó)，郭 軍，王瑞生，姬聰慧

（重慶市畜牧科學(xué)院蜂業(yè)研究所，重慶 榮昌 402460）

蜜蜂傳染性病害主要包括歐洲幼蟲腐臭病、美洲幼蟲腐臭病、敗血??；囊狀幼蟲病、麻痹病等；白堊病、黃曲霉病等；螺原體病以及侵襲性疾病中的蜜蜂微孢子蟲病、阿米巴病。這些疾病往往是危害養(yǎng)蜂生產(chǎn)的主要疾病。

1 主要診斷方法

1.1 培養(yǎng)鏡檢診斷方法 此方法主要用于鑒定蜜蜂細(xì)菌病、真菌病及原生動(dòng)物引起的疾病，并且要求病菌在形態(tài)和染色上具有明顯的特征。在沒有細(xì)胞系可利用的情況下，培養(yǎng)是不能夠利用的。病原培養(yǎng)是診斷的基礎(chǔ)和核心，對(duì)于不同的病原要加以區(qū)分，并且有的病原在培養(yǎng)條件上有嚴(yán)格的要求（如蜜蜂幼蟲芽孢桿菌），這就給鑒定帶來了一定的難度。Alippi在1995年發(fā)明了一種半選擇培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有萘啶酸和吡哌酸，能夠在幼蟲芽孢桿菌孢子萌發(fā)之前抑制大部分芽孢桿菌的生長(zhǎng)，為芽孢桿菌的培養(yǎng)提供了依據(jù)。Peter E.Lee和B.Furgala在1965年和1967年先后用鏡檢法對(duì)蜜蜂囊狀幼蟲病進(jìn)行了檢測(cè)。有些病原體到目前為止，還沒有可行的體外培養(yǎng)方法（如蜜蜂微孢子蟲），而且體外培養(yǎng)耗時(shí)，不能夠規(guī)?；M(jìn)行。

1.2 免疫學(xué)診斷方法 免疫學(xué)診斷建立在抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生可見反應(yīng)這一原理的基礎(chǔ)上，有的反應(yīng)不可見或難測(cè)，可以通過應(yīng)用補(bǔ)體、溶血以及熒光素、酶和同位素標(biāo)記等指示物質(zhì)，使其反應(yīng)成為可見或可測(cè)的狀態(tài)。血清學(xué)方法具有嚴(yán)格的特異性和較高的敏感性，在傳染病的診斷、病原微生物的分類和鑒定以及抗原分析、免疫抗體監(jiān)測(cè)等方面，均有較廣泛的應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)不僅表現(xiàn)在可利用抗體來診斷未知的抗原或用已知的抗原來診斷未知抗體，還可以進(jìn)行定量定性分析。血清學(xué)診斷方法很多，目前用于蜜蜂傳染病診斷的主要有瓊脂免疫擴(kuò)散法、對(duì)流免疫電泳法、熒光抗體法（IFA）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。高純度抗體的獲得是進(jìn)行血清學(xué)診斷的核心問題，目前主要是通過差速離心法獲取。

1.2.1 瓊脂免疫擴(kuò)散法 免疫擴(kuò)散法的原理：抗體和抗原在同一凝膠內(nèi)擴(kuò)散，兩者相遇后會(huì)出現(xiàn)具有一定特征的沉淀帶，從而判斷抗體是否存在或者抗原性是否一致。Denis L.Anderson對(duì)蜂王黑變病病毒（BQCV）、慢性麻痹病毒（CBPV）、克什米爾病毒（KBV）和囊狀幼蟲病病毒（SBV）利用瓊脂免疫擴(kuò)散法進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果證明此方法只有千分之一的敏感性，且特異性不明顯。

瓊脂本身性質(zhì)易受溫度影響，溫度過低，易凍住而變硬失效；溫度偏高，則擴(kuò)散環(huán)模糊，誤差偏大。瓊脂擴(kuò)散法對(duì)加血清的要求嚴(yán)格，首先是加樣器，有條件者可選用微量移液管，并且應(yīng)垂直并完全加入孔中，切勿使樣品外溢，否則結(jié)果不準(zhǔn)確；瓊脂擴(kuò)散法在測(cè)量沉淀環(huán)直徑時(shí)，除用米尺外，可改用目鏡測(cè)微器，其誤差小于0.1mm，效果更好。瓊脂擴(kuò)散板在溫箱內(nèi)要保持水平狀態(tài)，擴(kuò)散時(shí)間不得超過48h，否則沉淀環(huán)可能呈橢圓形，不便測(cè)量；瓊脂擴(kuò)散法室內(nèi)重復(fù)性不理想；瓊脂擴(kuò)散法是以沉淀環(huán)直徑與抗原含量的直線關(guān)系來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的，如曲線繪制不精密，誤差也會(huì)相應(yīng)增大。

1.2.2 對(duì)流免疫電泳法 對(duì)流免疫電泳法的原理：抗原在堿性緩沖液中（pH 8.4以上）帶負(fù)電荷，可由負(fù)極向正極移動(dòng)，而血清中抗體接近等電點(diǎn)，由于電滲作用，可由正極向負(fù)極滲透，兩者在短時(shí)間內(nèi)相遇后，出現(xiàn)白色沉淀線，根據(jù)沉淀線存在與否及沉淀量的多少，可以定量檢測(cè)出樣品中抗原或抗體的存在及含量。根據(jù)出現(xiàn)沉淀線和抗原稀釋倍數(shù)最高一孔的稀釋度，可以測(cè)定出被測(cè)血清的效價(jià)和應(yīng)用價(jià)值。

本法由于電場(chǎng)的作用，限制了抗原、抗體的自由擴(kuò)散，使其定向泳動(dòng)，因而增加了試驗(yàn)的靈敏度，并縮短反應(yīng)時(shí)間。此法操作簡(jiǎn)便，僅需30～60min，靈敏度比雙向瓊脂擴(kuò)散高10～15倍，但缺點(diǎn)是特異性不如雙向瓊脂擴(kuò)散高。

1.2.3 熒光抗體法 熒光抗體法的原理是利用異硫氰熒光素與抗體或者抗原生成復(fù)合物，以此測(cè)定抗體或者抗原的一種方法。熒光標(biāo)記抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下如果有沉淀產(chǎn)生，則會(huì)在沉淀物弧中出現(xiàn)熒光。依據(jù)熒光的強(qiáng)度和分布，就能檢測(cè)抗原的含量和判斷抗原是否存在。

熒光抗體技術(shù)在臨床檢驗(yàn)上已用于對(duì)細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢驗(yàn)及自身免疫病的診斷等，在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中主要用于菌種的鑒定。本法較其他鑒定細(xì)菌的血清學(xué)方法速度快、操作簡(jiǎn)單、敏感性高，但在細(xì)菌實(shí)驗(yàn)診斷中，一般只能作為一種補(bǔ)充手段使用，不能代替常規(guī)診斷。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法（簡(jiǎn)稱ELISA）始于20世紀(jì)70年代，是一種把抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面，測(cè)定時(shí)將受檢樣品（含待測(cè)抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)，形成抗原或抗體復(fù)合物；反應(yīng)終止時(shí)，固相載體上的酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合量（免疫復(fù)合物）即與標(biāo)本中待檢抗體或抗原的量呈一定比例，經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中的其他物質(zhì)，再加入酶反應(yīng)底物后，底物就被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量就可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。ELISA法比其他免疫學(xué)診斷方法的靈敏度高，特異性強(qiáng)。但也不可避免地存在著一些缺陷，如不能同時(shí)分析多種成分，對(duì)試劑選擇性高，對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)等。

1.3 PCR檢測(cè)診斷 PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是由美國(guó)科學(xué)家于1983年發(fā)明的一種特異基因或克隆序列的體外酶促擴(kuò)增技術(shù)，隨后PCR技術(shù)迅速發(fā)展，各國(guó)研究人員也對(duì)其進(jìn)行了不斷改進(jìn)。目前已經(jīng)有10余種不同類型的PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。

GOVAN等將PCR技術(shù)應(yīng)用在蜂球囊菌的檢測(cè)上，結(jié)果表明此技術(shù)耗時(shí)短，特異性較高。LAURO等提出利用套式PCR可直接檢測(cè)蜂蜜和蜂巢中的幼蟲芽孢桿菌孢子，且靈敏度非常高，不僅可以用于美洲幼蟲腐臭病的病情預(yù)報(bào)，還可以用于實(shí)時(shí)流行病學(xué)研究。GRABENSTE INER等對(duì)不同地區(qū)的囊狀幼蟲病毒利用逆轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行檢測(cè)，獲得了一致的檢測(cè)結(jié)果，此方法快速、靈敏，是檢測(cè)囊狀幼蟲病病毒的有效方法。WEBSTER等利用特異性PCR引物可以迅速檢測(cè)到蜜蜂體內(nèi)的微孢子蟲，與傳統(tǒng)的顯微鏡診斷相比,靈敏度大大提高。Elke Genersch建立了RT-PCR檢測(cè)方法，此方法在檢測(cè)蜜蜂殘翅病病毒上具有良好的呈現(xiàn)性。Elvira Grabensteiner等建立了復(fù)合TR-PCR，同時(shí)對(duì)蜂王黑變病、囊狀幼蟲病和急性蜜蜂麻痹病進(jìn)行了檢測(cè)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)敏感性和特異性，并且重現(xiàn)性良好。

近年，我國(guó)利用PCR技術(shù)在蜜蜂疾病的檢測(cè)上也開始應(yīng)用。周婷等利用RT-PCR對(duì)我國(guó)蜜蜂克什米爾病毒（KBV）和急性麻痹病毒（APV）進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，到目前為止我國(guó)還沒有蜜蜂對(duì)這兩種病毒有感染。許益鵬等利用Nest-PCR對(duì)囊狀幼蟲病病毒進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明此方法可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出病毒，可用于對(duì)囊狀幼蟲病的前期診斷。李明等報(bào)道，利用RT-PCR可以快速檢測(cè)出蜜蜂是否感染囊狀幼蟲病病毒。

PCR技術(shù)相對(duì)于其他檢測(cè)方法來說，具有快速、靈敏、耗時(shí)短的優(yōu)勢(shì)，但其本身也存在一些問題，例如由于各種污染引起的假陽性問題，尤其在病原微生物上表現(xiàn)突出；由儀器、試劑、操作等引起的假陰性問題；另外，由于蜜蜂病原樣本的采集存在一定的難度，并且病菌含量小，對(duì)檢測(cè)的靈敏度具有較高的要求。

2 結(jié)語

對(duì)蜜蜂病害的的防治目前還停留在臨床診斷階段，近幾年病害發(fā)病率有回升趨勢(shì)，而且由于臨床癥狀在初期均不典型或者呈隱性感染，容易出現(xiàn)誤診情況，而當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，已經(jīng)造成經(jīng)濟(jì)損失。目前常用的培養(yǎng)鏡檢診斷由于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，病原的培養(yǎng)條件苛刻，不能大規(guī)模進(jìn)行，在實(shí)驗(yàn)室診斷上意義不大。而免疫學(xué)反應(yīng)，由于血清的獲取至少也得30d時(shí)間，故不能作出快速診斷，另一些血清學(xué)檢測(cè)方法獲得的抗原特異性差、敏感性低，容易和其他病原存在抗原性交叉，產(chǎn)生假陽性，而且不能一次確診，所以對(duì)一些潛在性或隱性傳染的疾病診斷價(jià)值不大。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，蜜蜂疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷必然會(huì)從最初的組織形態(tài)學(xué)觀察向細(xì)胞分子診斷水平方向發(fā)展。分子技術(shù)的發(fā)展在診斷蜜蜂疾病上是一次革命，尤其是對(duì)蜜蜂病原核酸序列的破譯，將會(huì)使病原的快速檢測(cè)、診斷成為可能。

[1]王建鼎，梁 勤，蘇 榮.蜜蜂保護(hù)學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[2]吳 杰.蜜蜂病敵害防治手冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[3]曲 芬，成 軍.細(xì)菌性感染實(shí)驗(yàn)室診斷的研究進(jìn)展[J].臨床內(nèi)科雜志，2003，20（11）：564-556.

[4]金湯東，陳盛祿.我國(guó)蜜蜂疾病發(fā)生趨勢(shì)與防治技術(shù)[J].中國(guó)蜂業(yè)，2007，58（2）：23-24.

[5]Elke Genersch.Development of a rapid and sensitive RT-PCR method for the detection of deformed wing virus， a pathogen of the honeybee[J].Veterinary，2005，169：121-123.

[6]曹連飛，李亞輝.PCR技術(shù)在蜜蜂疾病診斷中的應(yīng)用[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（6）：794-798.

[7]顏 殉，韓日疇.我國(guó)蜜蜂主要病原檢測(cè)技術(shù)[J].昆蟲知識(shí)，2008，45（3）：483-488.

[8]王 忠，叢艷峰，李玉玲.小鵝瘟血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009，（1）：88-89.

[9]周 婷，姚 軍.蜜蜂KBV和APV病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（4）：359-462.

[10]李 明，馬嗚瀟，等.遼寧地區(qū)中華蜜蜂囊狀幼蟲病的RT-PCR 檢測(cè)[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2008，（12）：25-27.

[11]許益鵬，章奕卿.蜜蜂囊狀幼蟲病毒病的Nest-PCR檢測(cè)[J].科技通報(bào)，2007，23（6）：824-827.

[12]Yanping Chen，Jay Evans， et al.Horizontal and vertical transmission of viruses in the honeybee[J].Invertebrate Pathology，2006，92：151-159.