豬多殺性巴氏桿菌的診斷技術(shù)

魏世安

(重慶市涪陵區(qū)龍橋街道畜牧獸醫(yī)站，重慶涪陵 408121)

豬呼吸道綜合征(PRDC)已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重要群發(fā)性疾病之一。豬多殺性巴氏桿菌是豬呼吸道綜合征(PRDC)的重要原發(fā)感染菌或繼發(fā)原菌。因此，其診斷技術(shù)越來越受到世界各國的重視。對多殺性巴氏桿菌的診斷技術(shù)的重要性突顯出來?，F(xiàn)將豬多殺性巴氏桿菌的診斷綜述如下。

一、臨床診斷

多殺性巴氏桿菌是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體，主要使動物發(fā)生出血性敗血病或傳染性肺炎。此菌廣泛分布與世界各地， PRDC的病原可分為原發(fā)和繼發(fā)病原兩類，正常存在與多種健康動物的口腔和咽部黏膜，當(dāng)動物處于應(yīng)激狀態(tài)，機體抵抗力低下時，細菌侵入體內(nèi)，大量繁殖并致病，發(fā)生內(nèi)源性傳染。

（一）流行病學(xué)特征根據(jù)流行病學(xué)特征多殺性巴氏桿菌病一年四季均可發(fā)病，多在春夏呈暴發(fā),且在同種或不同種動物間可互相傳染，蜱和蚤被認為是自然傳播的媒介昆蟲。

臨床癥狀表現(xiàn)為病豬突然發(fā)病，死亡率高。多數(shù)體溫升高到41.5℃～42.0℃，食欲減退或廢絕，全身衰弱、臥地不起，煩躁不安，咳嗽氣喘，呼吸困難，心跳加快，頸下咽喉部發(fā)熱、紅腫、堅硬，嚴重者向上蔓延及耳根，向后達及胸前，糞便干燥或腹瀉，呈暗綠色，并帶有惡臭等為特征疾病。發(fā)病后，迅速死亡，也可能拖延3～5 d。視具體情況而定。

（二）病理剖檢病豬剖檢，可以發(fā)現(xiàn)皮下組織可見出血點，主要病變以咽喉部及其周圍結(jié)締組織、淋巴結(jié)的漿液性出血炎癥和喉頭氣管內(nèi)充滿淡黃色膠胨樣分泌物為特征?？梢姷酱罅康哪z胨樣淡黃色纖維素漿液。水腫自頸部延至前肢；全身淋巴結(jié)有輕度的腫脹、出血、切面深紅；心包膜有小出血點；肺水腫，呈紅白相間的大理石花紋，肺胸膜表面可見到紅褐色到灰紅色斑點狀病變區(qū)，胸腔積液，大多數(shù)病變在膈葉，有小指頭到雞蛋大小的局部性化膿灶、出血灶，嚴重者胸膜常有纖維素性附著物，肺泡腔、細支氣管、支氣管腔內(nèi)有嗜中性粒細胞浸潤，伴有黏膜上皮纖維素性變化、脫落，肺呈大葉性肺炎，間質(zhì)水腫出血，粘連性纖維素性胸膜炎； 脾有出血。

（三）診斷技術(shù)

1.實驗室微生物學(xué)診斷技術(shù)。實驗室微生物學(xué)診斷可分為以下三部分。

（1）顯微鏡檢查。取病豬的滲出液、心血、肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等新鮮組織涂片或觸片，以瑞氏染色液或堿性美蘭液染色時，鏡檢可見典型的兩極著色的短桿菌，即菌體兩端染色深，中間淺，無鞭毛，不形成芽孢，有莢膜，即可初步診斷。純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色、鏡檢，可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性球桿狀或短桿狀菌。

（2）細菌分離、培養(yǎng)與鑒定。分離培養(yǎng)可用病豬肺組織、肝臟、心血等新鮮病料，接種鮮血瓊脂平板、馬丁氏血清瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和血清肉湯培養(yǎng)基，馬丁氏血清瓊脂平板上菌落呈圓形、微隆起、灰白色露滴狀，中等大小。在血瓊脂平板上長成水滴樣小菌落，無溶血現(xiàn)象。在血清肉湯中培養(yǎng)，開始輕度渾濁，4～6 h后液體變清亮，管底出現(xiàn)粘稠沉淀，震搖后不分散，表面形成菌環(huán)。在麥康凱瓊脂上不生長。巴氏桿菌可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇和半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、鼠李糖、楊苷、肌醇和菊糖，產(chǎn)生H2S, 能形成靛基質(zhì)，觸酶和氧化酶均為陽性，M.R.和V-P試驗均為陰性，石蕊牛乳無變化，不液化明膠。

（3）動物實驗?？捎貌×现瞥?:10懸液，或用已制成的分離培養(yǎng)菌，皮下注射小鼠、家兔或鴿，動物多在24～48 h內(nèi)死亡。由于健康動物呼吸道內(nèi)?？蓭Ь?，所以應(yīng)參照病畜的生前臨床癥狀和剖檢變化，分離培養(yǎng)、生化特性作出最后診斷。

若要鑒定莢膜抗原和菌體抗原型，則要用抗血清或單克隆抗體進行血清學(xué)實驗。檢測動物血清中的抗體，可用試管凝集、間接凝集、瓊脂擴散實驗或ELISA等方法。

2.PCR診斷技術(shù)。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)作為一種分子生物學(xué)實驗技術(shù)，具有快速、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好、易于標化和操作等優(yōu)點，對檢測標本中病原體的核苷酸特異片段具有常規(guī)診斷方法不具備的一些優(yōu)點，且應(yīng)用于細菌、病毒的診斷及檢測已有較多的報道，因此用PCR技術(shù)檢測多殺性巴氏桿菌對多殺性巴氏桿菌病的診斷鑒定可取得準確的結(jié)果。

在PCR的診斷及檢測中DNA模板的質(zhì)量是影響PCR檢測靈敏度的個重要因素。其中細菌DNA提取可用豬多殺性巴氏桿菌菌落，用常規(guī)SDS裂解法和常規(guī)煮沸裂解法(DNA快速抽提法)提取DNA作為PCR反應(yīng)的DNA模板，且實踐證明雖然兩種方法敏感度相當(dāng)，但DNA快速抽取法更簡便、節(jié)時。同一濃度的多殺性巴氏桿菌分別用這兩種方法DNA，并通過蛋白核酸測定儀測定DNA濃度，兩者差異不大。但由于SDS會抑制Taq酶活性，必須用酚-氯仿反復(fù)抽提，操作繁瑣，常導(dǎo)致豬多殺性巴氏桿菌DNA提取純度受到影響，而使本PCR方法不穩(wěn)定。與常規(guī)煮沸裂解法比較，在豬多殺性巴氏桿菌的DNA模板處理過程，配以應(yīng)用快速延伸Taq酶，可縮短PCR操作時間。

二、總結(jié)

目前對豬多殺性巴氏桿菌病的診斷常采用實驗室微生物學(xué)診斷，即病變組織的涂片染色鏡檢和病原分離，純化、生化鑒定等方法，但這些方法較繁雜、費時。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)作為一種分子生物學(xué)實驗技術(shù)，具有快速、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好、易于標化和操作等優(yōu)點，對檢測標本中病原體的核苷酸特異片段具有常規(guī)診斷方法不具備的一些優(yōu)點，且應(yīng)用于細菌、病毒的診斷及檢測，在對豬多殺性巴氏桿菌病以及很多疾病的診斷上已有較多的報道，展示了PCR方法良好的應(yīng)用前景。

（略）