冬凌草甲素對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定結(jié)直腸癌的作用在體研究

戴功建,金黑鷹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院全國(guó)肛腸醫(yī)療中心,江蘇南京,210001)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤,化療是其主要治療手段之一,新型抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)利用是目前研究的主要課題。冬凌草甲素是一種從唇形香茶菜屬植物中提取的一種貝殼杉烯二萜類天然有機(jī)化合物,近年來(lái)的研究表明冬凌草甲素對(duì)體內(nèi)的各種腫瘤都有一定的抑制作用,臨床上報(bào)導(dǎo)對(duì)食管癌、胃癌的應(yīng)用取得了一定的療效[1-2],但在結(jié)直腸癌的研究鮮有報(bào)導(dǎo)。從分子生物學(xué)上,結(jié)直腸癌可以分為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)和微衛(wèi)星穩(wěn)定性2種,MSI結(jié)直腸癌占結(jié)直腸癌的20%～30%,是由于錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺失,DNA復(fù)制錯(cuò)誤增加,微衛(wèi)星不穩(wěn)定,導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生[3]。許多研究認(rèn)為冬凌草甲素明顯激活了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的各個(gè)階段和抗凋亡作用[4-5]。本研究繼續(xù)探索冬凌草甲素對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌的作用,旨在為其抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株:Lovo細(xì)胞(hMSH2缺失結(jié)腸癌細(xì)胞株)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

冬凌草甲素制備:冬凌草甲素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所標(biāo)準(zhǔn)品,以蒸餾水配置成50 mg/mL的溶液,滅菌后備用。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/C nu/nu裸鼠,SPF級(jí),購(gòu)自北京科麗華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重24～28 g,分籠飼養(yǎng)于獨(dú)立送風(fēng)籠具,室溫控制在24℃～25℃,相對(duì)濕度50%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng):人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株(Lovo、SW480)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。Lovo、SW480細(xì)胞以 RPMI-1640培養(yǎng)基,10%小牛血清,在37℃,5%CO2培養(yǎng),0.25%胰酶-EDTA消化,PBS洗2次,調(diào)整細(xì)胞濃度制成1×106的細(xì)胞懸液。

裸鼠皮下接種模型的建立:裸鼠頸部右側(cè)皮膚消毒,用一次性1 mL注射器將Lovo細(xì)胞懸液注入皮下0.2 mL/只。注射完畢后,對(duì)注射部位進(jìn)行觀察,約4周成瘤,對(duì)成瘤小鼠進(jìn)行觀察,待其自然死亡后解剖觀察腫瘤特點(diǎn),腫瘤在肺、肝、腸系膜處轉(zhuǎn)移情況。

結(jié)腸造口結(jié)腸癌原位移植模型的建立 氯胺酮(0.17 mg/mL)裸鼠腹腔注射麻醉,左腹部碘酊消毒,將皮膚及腹膜剪一小口,將裸鼠盲腸提出腹壁約0.5 cm,以5-0縫線將盲腸與周圍皮膚縫合固定,術(shù)后注意補(bǔ)充葡萄糖生理鹽水,加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng),術(shù)后2～3 d造口部位會(huì)結(jié)痂,約1周結(jié)痂脫落,露出腸道。術(shù)后4周取裸鼠皮下接種腫瘤,切取1 mm3的腫塊2塊,種植于造口處盲腸,待腫瘤生長(zhǎng)至5 mm時(shí)開(kāi)始進(jìn)行冬凌草甲素處理。

分組及用藥:選取已結(jié)腸造口結(jié)腸癌原位移植模型40只,設(shè)空白對(duì)照組10只、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg和10 mg/kg冬凌草甲素處理組各10只。冬凌草甲素組予以相應(yīng)劑量冬凌草甲素腹腔注射,1次/d,對(duì)照組予以等體積生理鹽水腹腔注射,連續(xù)5 d,觀察腫瘤增長(zhǎng)情況。

腫瘤體積和抑制率計(jì)算:分別于用藥前、用藥后 1、2、3、4和 5周末測(cè)量在體腫瘤大小,計(jì)算腫瘤體積和腫瘤抑制率。Genescan方法檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況和TGFβ1、TGFβ2和 IGF片段的大小變化。腫瘤體積估計(jì)公式為:(腫瘤長(zhǎng)軸×腫瘤短軸2)/2;腫瘤抑制率估算公式:(用藥后腫瘤體積-用藥開(kāi)始腫瘤體積)/用藥開(kāi)始腫瘤體積。

腫瘤組織中MSI以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2和胰島素樣生長(zhǎng)因子片段的大小變化檢測(cè):分別于用藥前和用藥后 3、7、14、21、28d于腫瘤處取材,采用Genescan法檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況,并檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、TGF-β2和胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)片段的大小變化,方法、使用試劑及引物序列參考文獻(xiàn)[6-7]。抽取基因組DNA,以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增上述片段,反應(yīng)體系20 μ L,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性15 min,94℃變性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,72℃充分延伸25 min。共30個(gè)循環(huán) 。取 1 μ L PCR 反應(yīng)產(chǎn)物與 0.4 μ L LIZ(內(nèi)標(biāo))和9 μ L甲酰胺混合,然后在ABI3100-Avant測(cè)序儀上毛細(xì)管電泳法電泳 45 min。DatacoLLection軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和處理,并生成原始的樣品數(shù)據(jù)文件。

2 結(jié) 果

2.1 使用冬凌草甲素處理結(jié)腸造口的結(jié)腸癌原位移植模型的結(jié)果

5.0 mg/kg、7.5 mg/kg和 10 mg/kg 3個(gè)治療組在注射冬凌草甲素后,1周開(kāi)始出現(xiàn)腫瘤的縮小,2～3周腫瘤縮小最多,在3周以后腫瘤開(kāi)始增長(zhǎng);而對(duì)照組腫瘤一直處理增長(zhǎng)狀況。在2、3、4、5周,治療組和對(duì)照組腫瘤抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);方差分析進(jìn)行3個(gè)治療組之間的腫瘤抑制率的比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 結(jié)腸造口的結(jié)腸癌原位移植模型的腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定和TGFβ1、TGFβ2和 IGF片段大小變化

在空白對(duì)照組,能擴(kuò)增到的4個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)志和TGFβ1、TGFβ2和 IGF 均出現(xiàn)延長(zhǎng)和縮短。在空白對(duì)照中,出現(xiàn)了MSI和一些簡(jiǎn)單重復(fù)序列的延長(zhǎng)和縮短,提示Lovo在增殖過(guò)程表現(xiàn)出明顯的含簡(jiǎn)單重復(fù)序列基因的突變,符合Lovo細(xì)胞的增殖特點(diǎn),在使用冬凌草甲素治療后,微衛(wèi)星標(biāo)志和攜帶簡(jiǎn)單重復(fù)序列的基因的變異仍呈現(xiàn)不穩(wěn)定趨勢(shì),較治療前無(wú)明顯變化。

3 討 論

冬凌草甲素具有抗腫瘤、抗突變的重要作用[8-9],目前研究認(rèn)為其抗腫瘤的作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用[10-11],在前期的研究中,發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細(xì)胞具有特異性的抑制作用,在一個(gè)比較小的劑量時(shí)即能達(dá)到比較高的腫瘤抑制率,其在體對(duì)于腫瘤治療的效果如何目前尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。許多研究表明,冬凌草甲素具有抗腫瘤和抗基因突變的作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對(duì)LOVO細(xì)胞有抑制作用,且抑制率可以達(dá)到 80%以上,對(duì)LOVO細(xì)胞的作用隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加、隨作用劑量的增加而增加,具有時(shí)間和劑量依賴特點(diǎn)。當(dāng)其濃度超過(guò)20 μ g/mL后其抑制率不再隨濃度的上升而提高,且經(jīng)過(guò)處理后LOVO細(xì)胞仍呈微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài),故冬凌草甲素不能抑制錯(cuò)配修復(fù)基因缺失的結(jié)直腸癌的基因突變的發(fā)生,但是,冬凌草甲素是怎樣抑制錯(cuò)配修復(fù)基因缺失的結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng),其具體機(jī)制需做進(jìn)一步的研究。

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