血漿microRNAs在慢性肝損傷診斷中的應用研究

江 梅綜述，萬臘根審校

(南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

MicroRNAs(miRNAs)是內源性無編碼功能的小分子單鏈RNA，長約21～23核苷酸，在轉錄后水平調節(jié)基因表達，參與機體各種重要的生理和病理過程。他們能夠與目標mRNA的3＇-UTR區(qū)互補配對，導致蛋白翻譯的抑制或mRNA的降解[1]。當它與mRNA不完全互補配對時，會抑制蛋白翻譯的過程；而當它與mRNA完全互補配對時，則切割或降解mRNA[2]。有學者預計人類基因組中大約有800余個miRNA，雖占總編碼RNA基因數(shù)量的1%，但調控著人類基因組中約20%～30%的基因[3]，1個miRNA可以調節(jié)多個蛋白編碼mRNA，參與發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生物學過程[4，5]，如胚胎發(fā)育、細胞生長和 凋亡、血細胞分化、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生和脂肪代謝等，隨著研究的進展，對miRNA的研究從量的表象變化已經(jīng)慢慢過渡到作用機制，進入了更深一步的研究。隨著檢測方法的進步，一個新的領域—循環(huán) miRNA也逐漸成為科研的熱點，成為潛在的檢測標志物和治療靶向點[6]。國內外很多文獻指出血循環(huán)中的miRNAs在血漿和血清中非常穩(wěn)定，不易被RNase降解，在極端的pH和反復凍融等條件下仍能保持穩(wěn)定[7]。慢性肝損傷是一個多因素多階段的病變過程，導致慢性肝損傷因素有：肝細胞炎癥的變性壞死、肝纖維化、脂肪肝、肝硬變等等。慢性肝損傷發(fā)展后果多為形成肝硬化或肝癌，導致患者死亡。因此對慢性肝損傷病人的早期診斷尤為重要。由于miRNA的大小，數(shù)量，組織特異性，以及血漿中的相對穩(wěn)定性，因此miRNA將是診斷和監(jiān)測相應特異組織損傷的分子生物學標志物。本文就血漿miRNA在診斷慢性肝損傷中的應用研究作一綜述。

1 血循環(huán)中m iRNA

肝臟組織細胞損傷、心肌細胞損傷等可導致某些特定循環(huán) miRNAS如 miR-122、miR-l及 miR-208a顯著升高[8]；結直腸癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等患者血漿或血清標本中也存在一些表達水平明顯升高的循環(huán)miRNA[9]，據(jù)文獻報道外周血循環(huán)miRNAs主要來源于凋亡或壞死細胞的主動釋放，以及循環(huán)細胞的裂解或是miRNAs被包裹在外核體中經(jīng)細胞分泌后釋放入外周血[10]，值得注意的是，在肝臟和血漿中共存在約93種miRNAS，其中67種可見于血漿中，55種可見于肝組織中，其中8種在所有人的肝組織中能檢測到，29種在所有人血漿中能檢測到，只有5種在所有人的肝組織和血漿中都能檢測到[11]，而miRNA在組織中高表達并不一定意味著血清中也高表達，Adaehi T等的檢測結果顯示miR574-3p和miR-146a在肝臟中的表達濃度也很高[12]，但未能進一步驗證二者在肝病患者血清中亦呈顯著高表達

2 血漿m iRNA與慢性肝炎

2.1 血漿miRNA與病毒性肝炎

我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū),尤其是慢性乙型肝炎，僅人群HBV感染率就高達60%，HBV攜帶者約1.2億人，其中約20%的HBV感染者可能發(fā)展成為慢性乙型肝炎 (chronic hepatitis B，CHB)，CHB已成為我國最廣泛、最嚴重的傳染病。 從已經(jīng)發(fā)表的miRNAs 表達譜數(shù)據(jù)中：miR-199a、miR-126、miR-181a、miR-122、miR-21、miR-223、miR-125b、miR-222和miR-150等與肝臟病變相關，其中在肝臟組織中有較高表達水平的miRNAs有 miR-122、miR-126、miR-125b；原發(fā)性肝癌組織中上調或下調具有顯著統(tǒng)計學意義的miRNAs有 miR-21、miR-125b、miR-223、miR-199a、m iR-222； 以及與病毒復制有關的 miRNAs有 miR-150、miR-181a[13-16]。賈音[17]等測定了這些miRNAs在慢性乙型肝炎肝損傷患者血漿樣本中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)上述與肝病相關的9個 miRNAs有 3個(miR-199a、miR-125b和 miR–122)，其血漿中的表達量具有統(tǒng)計學意義，其中miR-122的變化最為顯著。桂俊豪[18]等選擇5種可能與肝病相關循環(huán)miRNAs(miR-885-5p，miR-215，miR-224，miR-574-3p和miR-146a)作為候選分子進行了初步驗證，經(jīng)過兩次獨立樣本驗證，最終結果顯示，CHB患者血清中miR-885-5p的表達水平顯著高于健康對照(P<0.01)，可能是由于機體免疫細胞可能存在持續(xù)的抗病毒活性并由此導致免疫細胞內源性miR-885-5p進入外周血。Xu[19]等用實時熒光定量RT-PCR檢測48例慢性乙肝患者及101例肝癌患者血清中的miR-21miR-122miR-223，結果與健康人相比明顯升高，且乙肝患者升高趨勢要比肝癌患者明顯，因此 miR-21，miR-122，miR-223 可作為慢性乙型肝炎肝損傷新的分子生物學標志。

2.2 血漿miRNA與酒精性肝炎、藥物性肝炎

慢性肝炎不但包括慢性病毒性肝炎，還包括酒精性肝炎、藥物性肝炎等等，酒精性肝損害主要是肝細胞氧化損傷，嚴重時可以誘發(fā)廣泛肝細胞壞死。在西方國家，酗酒是發(fā)生慢性肝炎的首要原因，而酒精性肝損傷導致的酒精性肝硬化占肝硬化病人的一半以上。藥物性肝病是由于藥物治療過程中肝臟受藥物本身、代謝產(chǎn)物損害或發(fā)生過敏反應所致。其危害包括肝臟血管損害、誘導肝癌和促使肝硬化等[20]。在全球所有藥物不良反應中，藥物性肝病發(fā)生率為3%～9%[21]，Zhang[22]等建立了兩種肝損傷小鼠模型(D-胺基半乳糖和酒精所致的肝損傷模型)來評估肝損傷，在D-胺基半乳糖所致的肝損傷模型中，早在腹腔注射0.5h后，就有血漿miR-122的增高，而且所有的小鼠均出現(xiàn)肝臟損傷的病理學變化，但是在此時間點，ALT的活性并沒有發(fā)生改變。酒精所致的肝損傷模型與D-胺基半乳糖所致的肝損傷模型檢測結果基本一致。而不同的是酒精所致的肝損傷模型中，0.5h并沒有發(fā)現(xiàn)小鼠的肝臟有組織病理學改變，在酒精灌胃更長的時間內才有了肉眼可以觀察到的病理學改變。與常規(guī)標志物ALT相比，在檢測這些類型的肝臟損傷時，miR-122可能是一個更加靈敏的指標，因為miR-122的表達水平改變可能還更先于肉眼可見的組織病理學變化。Wang[11]等發(fā)現(xiàn)藥物(對乙酰氨基酚)直接損傷肝細胞時大鼠血漿中循環(huán)miRNAs的表達譜發(fā)生明顯變化，miR-192、miR-122在對照組和實驗組的血漿及肝組織中也極大不同，其中miR-122可急劇升高400倍以上，而miR-710和miR-711的表達則明顯下調。因此，循環(huán)miRNAS有望成為一類監(jiān)測酒精性肝炎、藥物性肝炎新型生物標志物。

3 血漿m iRNA與肝纖維化、肝硬化

肝纖維化是各種原因包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、中毒性肝病、自身免疫性肝病等導致肝臟損害后的一種修復過程,其結局是形成肝硬化,成為消化內科常見的難治疾病[23-24]。肝纖維化發(fā)生機制還未完全明了，肝星狀細胞的激活是肝纖維化發(fā)生的早期關鍵事件，但最基本的細胞事件不外乎是細胞分化、增生和凋亡。 而這些正是miRNAs所調節(jié)的.Ji[25]發(fā)現(xiàn) miR-27a、miR-27b 在肝星狀細胞激活后明顯上調，此外上調的還有miR-30a、miR-30c、miR-30d。miR-29a、miR-29b 表達下調也參與肝星狀細胞激活[26]。至于肝纖維化過程中血漿microRNAs表達水平未見報道，有待進一步研究。在其發(fā)展為肝硬化后患者血漿中的microRNAs表達水平已有學者作出了驗證。Gui[27]等發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清中miR-122的濃度較健康對照高了5.2倍，miR-192的濃度相應升高8.9倍，而血清中miR-885-5P的表達水平較健康組分別升高8.8倍(P＜0.01)，血清中miR-146a和miR-224的水平明顯高于健康組(P＜0.05 和 P＜0.01)，而 miR-574-3p 的表達水平在健康組和肝硬化組未見統(tǒng)計學差異，miR-215的檢出率太低而未作統(tǒng)計分析。因此，循環(huán)miR-122、miR-192、miR-885-5p 有望成為一類監(jiān)測肝硬化的新型生物學標志物。

4 循環(huán)m iRNA檢測

目前循環(huán)miRNA檢測方法主要有：高通量測序法(Illumina/Solexa)、微陣列法、Northern blot法和熒光實時定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)法。目前也研究出了一些在此基礎上的改良方法。如：LNA的探針雜交技術，核糖核酸酶保護法 (RNase protection assay，RPA)，微陣列芯片技術(Microarray)等。 循環(huán)miRNA表達與定量檢測最常用的方法是 qRT-PCR法，此方法操作快速、簡便、高效，而且具有很高的敏感性和特異性。目前miRNA檢測的qRT-PCR方法主要是基于莖-環(huán)的RT-PCR方法 (stem-loop RTPCR)和基于 poly(A)加尾的RT-PCR方法。莖環(huán)反轉錄法的優(yōu)勢主要在于其反轉錄特異性較高，可反轉錄出與目的miRNA互補的一條或幾條miRNA的cDNA第一鏈，然后通過特異的正向引物進行后續(xù)的熒光定量PCR檢測。此法特異性強，但是引物設計較為繁瑣和困難。加尾法反轉錄幾乎將所有的成熟的miRNA加上Poly(A)的尾巴后進行反轉錄獲得cDNA。通過特異的正向引物進行后續(xù)的熒光定量PCR檢測，此法引物設計簡便，通用性好。

5 展望

microRNAs(miRNAs)作為轉錄后水平調節(jié)基因，參與機體的各種重要的生理和病理過程。在不同生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下，miRNA表達譜發(fā)生明顯變化。目前，對于組織損傷后，循環(huán)中特異性的miRNA的研究并不多，研究并構建不同病理生理狀態(tài)下循環(huán)miRNAS表達譜，對于疾病診斷、療效判斷及預后評估等無疑更具有吸引力[28]。檢測循環(huán)中的miRNAs作為一種創(chuàng)傷性小，快速，簡便的診斷方法，隨著技術的成熟，想必將來會廣泛地應用于臨床診斷，尤其是監(jiān)測早期的特異性的組織損傷。雖然不同疾病相關循環(huán)miRNA的種類、產(chǎn)生機制和作用還不完全清楚，但相信隨著RNA、DNA和蛋白質三大生物分子學研究的深入，將會很好地解決這些還未明確的問題，為疾病的預測、診斷和治療效果的監(jiān)測開辟更廣闊的前景。

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