提高牛、羊胚胎冷凍保存效果的措施

佟桂芝 宋斌 董正德 李信濤 王偉霞 李乃順

摘要：胚胎冷凍保存是胚胎生物技術(shù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在質(zhì)量型畜牧業(yè)發(fā)展中起著非常關(guān)鍵的作用。而我國(guó)牛、羊體內(nèi)（外）胚胎冷凍效果還沒(méi)有達(dá)到人們預(yù)期的水平，從而限制了胚胎移植技術(shù)的商業(yè)化推廣應(yīng)用。需要突破的技術(shù)瓶頸問(wèn)題是胚胎冷凍、解凍過(guò)程中受到機(jī)械損傷以及保護(hù)劑毒性影響。因此在胚胎冷凍保存中各種抗凍保護(hù)劑及冷凍方法要相互結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，針對(duì)不同發(fā)育階段胚胎而篩選合適的冷凍保護(hù)劑及冷凍保存方法，同時(shí)簡(jiǎn)化冷凍一解凍程序，我們應(yīng)尋找無(wú)需昂貴的冷凍設(shè)備、操作時(shí)間短、易推廣的方法。對(duì)于胚胎冷凍胚胎移植流產(chǎn)率高、妊娠率及產(chǎn)仔率低等現(xiàn)象還需進(jìn)一步研究。植物抗凍蛋白在豬胚胎玻璃化保存上的成功應(yīng)用，使得此項(xiàng)技術(shù)能在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用，研究?jī)?nèi)容的意義較大。

關(guān)鍵詞：牛；羊；胚胎；冷凍；保存；效果

中圖分類號(hào)：S852.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-9737（2018）07-0011-01

1 篩選質(zhì)量?jī)?yōu)級(jí)胚胎進(jìn)行冷凍保存

冷凍前羊胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的質(zhì)量不高，細(xì)胞碎片多，會(huì)使每個(gè)卵裂球的完整程度差，細(xì)胞脫水與冷凍保護(hù)劑滲透到細(xì)胞過(guò)程的平衡遭到破壞。所以，掌握冷凍前根據(jù)胚胎日齡進(jìn)行羊胚胎質(zhì)量分級(jí)技術(shù)是關(guān)鍵技術(shù)之一。胚胎細(xì)胞形態(tài)是影響冷凍胚胎質(zhì)量的關(guān)鍵因素，是直接影響移植后胚胎存活率及妊娠率的重要因素。

2 胚胎不同發(fā)育階段

胚胎冷凍能否存活的關(guān)鍵在于細(xì)胞脫水和保護(hù)劑滲透到細(xì)胞的過(guò)程是否達(dá)到平衡。用于冷凍保存的牛、羊胚胎是體內(nèi)（外）受精六七天，處于桑椹、囊胚、擴(kuò)張囊胚階段胚胎。處于不同發(fā)育階段的胚胎形態(tài)、細(xì)胞數(shù)量及特性均有所不同，對(duì)冷凍及解凍過(guò)程中的機(jī)械損傷及保護(hù)劑毒性的耐受能力不同。囊胚和擴(kuò)張囊胚細(xì)胞數(shù)比桑椹胚的體積小而細(xì)胞數(shù)多。桑椹胚的細(xì)胞數(shù)少而體積大，胚胎細(xì)胞充分脫水難而且慢，胚胎冷凍、解凍后活力低，移植妊娠率和產(chǎn)仔率低。研究表明，甘油冷凍劑冷凍牛、羊胚胎，采用常規(guī)慢速冷凍法時(shí)，囊胚、擴(kuò)張囊胚解凍后移植受胎率，產(chǎn)仔率均明顯高于桑椹胚；囊胚和擴(kuò)張囊胚之間差異不顯著。表明甘油冷凍劑更適合冷凍處于囊胚、擴(kuò)張囊胚階段的胚胎。對(duì)于桑椹胚：由于乙二醇冷凍保護(hù)劑的分子量小，可以快速滲入胚胎細(xì)胞，冷凍胚胎的卵裂球保持了高度的一致性，外部形態(tài)特征沒(méi)有任何的變化；甘油的分子量較大，作為胚胎冷凍保護(hù)劑時(shí)，桑椹胚卵裂球所處位置與卵裂球受保護(hù)程度有關(guān)，桑椹胚卵裂球位于桑椹胚外部的形態(tài)保存正常完整，而卵裂球位于桑椹胚內(nèi)部的容易被破壞。所以，對(duì)于牛、羊不同發(fā)育階段的胚胎建議采用不同的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存，處于囊胚、擴(kuò)張囊胚階段的胚胎宜采用乙二醇作冷凍劑，桑椹胚宜采用甘油作為胚胎冷凍保護(hù)劑效果會(huì)更好。

3 胚胎的冷凍方法

胚胎冷凍、解凍時(shí)，必須經(jīng)過(guò)冷凍、解凍過(guò)程，此時(shí)的危險(xiǎn)溫區(qū)是15℃～- 50℃。如果操作不當(dāng)、冷凍保護(hù)劑選擇不當(dāng)或冷凍方法不當(dāng)，均能在胚胎內(nèi)形成的大冰晶，對(duì)胚胎細(xì)胞造成機(jī)械性破壞，損傷蛋白質(zhì)的硫氫鍵，發(fā)生胚胎死亡。因此常規(guī)的低溫冷凍法就是：在冷凍牛、羊胚胎時(shí)，篩選幾種低毒的保護(hù)劑進(jìn)行搭配使用，采用合適的降溫措施，使胚胎細(xì)胞內(nèi)達(dá)到玻璃化狀態(tài)時(shí)，使其能在超低溫條件下長(zhǎng)期保存。目前已在世界范圍內(nèi)進(jìn)行人及哺乳動(dòng)物胚胎的冷凍保存應(yīng)用。常規(guī)慢速冷凍法的優(yōu)點(diǎn)是解凍后胚胎的存活率較高，適合規(guī)?；咛ダ鋬觯@種方法胚胎冷凍程序較繁瑣、費(fèi)時(shí)，成本高。玻璃化冷凍（ Vitrification）不需要昂貴的程序降溫儀，因此進(jìn)行牛、羊胚胎冷凍保存的成本低廉。細(xì)胞外液不生成冰晶，避免了物理性的機(jī)械損傷對(duì)胚胎細(xì)胞造成的死亡，操作簡(jiǎn)單。通過(guò)篩選毒性更小、滲透性更強(qiáng)的胚胎冷凍保護(hù)劑組合，將多種不同類型胚胎冷凍保護(hù)劑配合使用，以降低每種保護(hù)劑特有的毒性。采取冷凍劑的濃度逐步添加，當(dāng)添加最終的高濃度保護(hù)劑時(shí)，在30 s內(nèi)將胚胎投入液氮中等措施，從而大大降低了冷凍保護(hù)劑的毒性，提高了冷凍胚胎的凍后活力。

3.1 常規(guī)慢速冷凍法

將卵母細(xì)胞或胚胎放入低濃度抗凍劑的冷凍保護(hù)液中，經(jīng)過(guò)2 min平衡、誘發(fā)結(jié)冰8 min后，以0.3—0.5℃/min的速率緩慢降溫35℃，停留10 min后投入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。從而使牛、羊胚胎細(xì)胞內(nèi)形成玻璃化狀態(tài)，卵母細(xì)胞或胚胎得以長(zhǎng)期保存。目前，常規(guī)慢速冷凍法為大多數(shù)動(dòng)物及人類胚胎學(xué)家所廣泛接受。這種方法在國(guó)外已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化應(yīng)用，適合大量的冷凍胚胎，但其主要缺點(diǎn)是冷凍程序較繁瑣、費(fèi)時(shí)，必須有昂貴的程序冷凍儀；而且冷凍牛、羊卵母細(xì)胞及體外胚胎時(shí)效果差。由于需要人工誘發(fā)結(jié)冰，然后以緩慢的降溫速率進(jìn)行降溫，這種胚胎冷凍保存方法雖然可靠，但需要專業(yè)的胚胎冷凍儀設(shè)備，并且操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)。且必須由專業(yè)技術(shù)人員操作，專用脫除抗凍劑的解凍液、體視顯微鏡和實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件，不利于在現(xiàn)場(chǎng)條件下進(jìn)行操作。因此制約了牛、羊胚胎移植技術(shù)的推廣應(yīng)用和胚胎生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

3.2 玻璃化保存法

長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，牛羊、胚胎玻璃化保存存在頗多爭(zhēng)議，研究證明，在各種冷凍方法中，牛、羊等哺乳動(dòng)物胚胎玻璃化保存是一種有效、實(shí)用的方法。經(jīng)過(guò)近20年研究，發(fā)明多種牛、羊體外胚胎玻璃化保存液（解凍液）和保存方法，效果明顯優(yōu)于常規(guī)冷凍法，但一直難于走出實(shí)驗(yàn)研究階段，使其真正在生產(chǎn)中得到商業(yè)化應(yīng)用。玻璃化保存技術(shù)不需要昂貴的冷凍設(shè)備、操作程序簡(jiǎn)單、省時(shí)，與傳統(tǒng)胚胎冷凍方法相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，有利于加速良種牛、羊的快速擴(kuò)繁及品種改良進(jìn)程，縮短世代間隔。

玻璃化冷凍前，胚胎在玻璃化液平衡過(guò)程中，環(huán)境溫度很重要。室內(nèi)溫度高時(shí)，平衡時(shí)間短成活率高：溫度太低時(shí)，平衡時(shí)間短并不能使存活率升高。因?yàn)樵诓ＡЩ褐?，乙二醇的滲透量起到關(guān)鍵作用。乙二醇的滲透量與環(huán)境溫度和平衡時(shí)間有關(guān)。室溫時(shí)、乙二醇進(jìn)入細(xì)胞速度快，細(xì)胞膜通透性好，需要的平衡時(shí)間短。較高溫度下經(jīng)過(guò)一個(gè)短時(shí)間處理是合適的，一般室溫為20℃或25℃。而在胚胎解凍過(guò)程中，環(huán)境的溫度同樣是很關(guān)鍵的因素之一。太高和太低對(duì)解凍胚胎的存活力都是不利的，不利于抗凍劑的脫出及胚胎的復(fù)水，室溫最好控制在30℃。

牛冷凍胚胎直接移植法可以避免胚胎解凍過(guò)程中，脫除冷凍劑過(guò)程所帶來(lái)的形態(tài)學(xué)檢查不精確、操作技術(shù)水平的誤差等問(wèn)題，操作省時(shí)、簡(jiǎn)便，不需要任何專門的設(shè)備，胚胎解凍直接移植。牛、羊胚胎冷凍后直接移植的方法能降低應(yīng)用胚胎移植配套技術(shù)推廣的費(fèi)用，提高妊娠率及產(chǎn)仔率，促進(jìn)了牛、羊胚胎冷凍生產(chǎn)商業(yè)化進(jìn)程，加速了品種改良。

4 冷凍保護(hù)劑

應(yīng)用常規(guī)冷凍保存法，在羊胚胎冷凍的過(guò)程中，甘油作冷凍保護(hù)劑，胚胎放人甘油冷凍劑中與胚胎放人乙二醇冷凍劑中的形態(tài)變化行為是不同的。乙二醇分子量小，滲入胚胎內(nèi)速度快，在顯微鏡下幾乎觀察不到胚胎形態(tài)的變化；甘油分子量較大，甘油滲入胚胎的速度慢，胚胎放入甘油冷凍劑中時(shí)，胚胎上浮，胚胎皺縮變小，嚴(yán)重脫水，隨著甘油的逐漸滲入，胚胎細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓達(dá)到平衡，胚胎才恢復(fù)原來(lái)的形狀，胚胎下沉至培養(yǎng)皿底。研究證明：牛、羊冷凍胚胎的移植受胎率，甘油和乙二醇作冷凍保護(hù)劑的受胎率并沒(méi)有顯著差異，甘油冷凍劑組的移植受胎率略好于乙二醇作冷凍保護(hù)劑組，二者作為胚胎冷凍保護(hù)劑均是可行的。羊胚胎冷凍，甘油作冷凍保護(hù)劑可以作為首選，因?yàn)檠虻睦鋬雠咛ミM(jìn)行移植時(shí)，需要進(jìn)行前裝管的處理過(guò)程；牛胚胎冷凍，可以首選乙二醇作冷凍保護(hù)劑，因?yàn)榕＠鋬雠咛ヒ浦矔r(shí)，不需要重新裝管的前處理過(guò)程，而是可以采用直接移植法。

總之，在胚胎的冷凍、解凍過(guò)程中，探尋最佳的冷凍保護(hù)劑組合、解凍后一步法脫出冷凍保護(hù)劑或者直接移植法，保證胚胎凍后的存活力，提高冷凍胚胎移植受胎率和產(chǎn)仔率，建立簡(jiǎn)便、快捷的胚胎冷凍解凍移植程序，加速推廣家畜良種化進(jìn)程，胚胎移植配套技術(shù)為牛、羊良種化提供技術(shù)保障。