營養(yǎng)造血湯劑對再生障礙性貧血小鼠骨髓造血功能的影響*

于敬達 徐能義 馬淑一 董 弘 李麗娜

（1.包頭醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)學院，內(nèi)蒙古包頭014060；2.內(nèi)蒙古婦幼保健醫(yī)院遺傳科，內(nèi)蒙古包頭014060）

再生障礙性貧血（再障）是因骨髓造血組織顯著減少，引起造血功能衰竭而發(fā)生的一類貧血。針對再障的發(fā)生與骨髓造血干細胞損傷、造血微環(huán)境缺陷、免疫性造血抑制等因素有關(guān)[1]，結(jié)合醫(yī)學營養(yǎng)學、中醫(yī)學的相關(guān)理論，探討營養(yǎng)造血湯劑對再生障礙性貧血的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、營養(yǎng)造血湯劑和主要試劑

近交系BALB/c小鼠90只，8～12周齡，雌雄各半，由大連醫(yī)科大學提供。營養(yǎng)造血湯劑由核苷酸、精氨酸、甘氨酸、維生素C、復合維生素B、當歸、白術(shù)、甘草、女貞子等組成，按原方比例配方，經(jīng)水煎、超聲、濃縮，配制成口服液，分裝備用。促紅細胞生成素（EPO）試劑盒，美國R&D systems公司；METHOCULTTM GF M3434培養(yǎng)基，加拿大Stem cell technologies公司；TUNEL試劑盒、Fas與Caspase-3檢測試劑盒，福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 實驗分組及流程

BALB/c小鼠90只，根據(jù)動物藥理學的藥品劑量（小鼠給藥劑量=成人給藥劑量×388/小鼠體重）和綜合實驗的設計分析，采用完全隨機數(shù)字表法均分為：①正常對照組；②再障模型組；③營養(yǎng)造血湯劑治療組[以19.76g/（kg·d）對小鼠灌胃]。苯、X射線、環(huán)磷酰胺三聯(lián)應用的方法建立再障小鼠模型[1]。從第8天開始，對治療組小鼠進行灌胃，每天1次，直至第60天，頸椎脫臼處死小鼠，采樣進行檢測。

表1 對照組與再障模型組小鼠外周血的相關(guān)指標數(shù)值（±s，n＝30）

表1 對照組與再障模型組小鼠外周血的相關(guān)指標數(shù)值（±s，n＝30）

注：與對照組比較具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05）；與模型組比較具有統(tǒng)計學意義（**P＜0.05）

EPO（pg/mL）46.64±10.06 879.53±90.92* 258.96±59.05**組別對照組模型組治療組Hb（g/L）164.32±10.74 80.11±13.65* 150.1±14.68** RBC（×1012/L）8.99±1.15 3.35±0.97* 6.53±1.25** WBC（×109/L）8.69±1.68 2.09±1.52* 4.81±0.69** PLT（×109/L）902.36±150.35 470.8±112.09* 807.±100.03**

表2 對照組與模型組小鼠骨髓的相關(guān)指標數(shù)值（±s，n＝30）

表2 對照組與模型組小鼠骨髓的相關(guān)指標數(shù)值（±s，n＝30）

注：與對照組比較具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05）；與模型組比較具有統(tǒng)計學意義（**P＜0.05）

Caspase-3陽性率(%) 0.88±0.51** 6.94±0.81 4.39±0.40**組別對照組模型組治療組BMNC（×106/根股骨）8.50±2.01 1.25±0.54* 6.87±0.58**集落數(shù)（個/2×106 BMNC）28.00±4.72 5.60±2.13* 23.3±6.2**凋亡率（%）5.23±0.28** 10.03±0.46 7.01±0.24** Fas陽性率(%) 14.90±1.78** 26.11±1.60 20.04±0.88**

1.3 指標檢測

檢測小鼠血紅蛋白含量、紅細胞、白細胞及血小板數(shù)；測定血清EPO含量。游離股骨，制備骨髓涂片、骨髓細胞懸液，繼而計數(shù)單核細胞數(shù)，調(diào)整細胞濃度至 1.5×105/mL，置于METHOCULTTM GF M3434培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d后進行集落計數(shù)[2]。5%硝酸溶液浸泡股骨7～12h脫鈣后,常規(guī)病理制片，觀察骨髓增生程度；TUNEL法免疫組化染色程序按說明書進行。細胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，隨機讀取100個細胞，計算陽性細胞率。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

詳見表1～2。

3 討論

研究表明，營養(yǎng)造血湯劑對改善再障小鼠骨髓抑制狀態(tài)有顯著促進作用，可進一步使造血干/祖細胞增殖、分化趨于正常，有利于造血支持成分的增生。其中甘氨酸為血紅素的基本原料，利于造血干細胞增殖。維生素C可防止脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定正常組織中DNA分子，刺激造血祖細胞，促進集落形成[3]。B族維生素可提高細胞內(nèi)微體的抗氧化防御能力，以改善骨髓造血微環(huán)境，有利于基質(zhì)細胞生長。核苷酸堿基的氮氧原子能夠捕獲氧化過程中形成的自由基，減少由脂質(zhì)過氧化引起的細胞膜及各種DNA的損傷，且具有維持免疫系統(tǒng)的正常功能，增強細胞免疫能力。精氨酸與賴氨酸有利于造血干細胞的基因復制，有利于EPO的分泌，刺激骨髓造血。

甘草酸是甘草的主要成分，可阻止Fas抗體介導的造血干細胞凋亡，有助于骨髓造血功能恢復。當歸對造血細胞增殖、分化有顯著刺激作用[4]，能降低再障小鼠骨髓細胞Fas抗原的表達，減少細胞凋亡，促進骨髓造血細胞增生。女貞子可提升外周白細胞數(shù)量，增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬作用，增強細胞免疫和體液免疫的作用。營養(yǎng)造血湯劑可減少骨髓造血細胞凋亡的發(fā)生，改善骨髓造血功能，明顯改善外周血象三系減低的狀況，對治療再生障礙性貧血安全有效，對臨床應用營養(yǎng)造血湯劑治療再障提供了試驗依據(jù)。

[1]于敬達,李得春.苯、X射線、環(huán)磷酰胺聯(lián)合復制小鼠再障模型實驗研究[J].包頭醫(yī)學院學報，2010，26（6）：25-27.

[2]Miller CL，Rebel VI，Lemieux ME，et al.Studies of W mutant mice provide evidence for alternate mechanisms capable of activating hematopoietic stem cells[J].Exp Hematol，1996，24（2）：185-194.

[3]Snyder R.Recent developments in the understanding of benzene toxicity and leukemogenesis[J].Drug Chem Toxicol，2000，23（1）：13-25.

[4]劉玉蘭，孟慶勇.當歸注射液對輻射損傷小鼠免疫功能的作用[J].廣東醫(yī)學院學報，2002，20（5）：334-335.