三種不同溶劑靜電紡絲素納米纖維的研究進展

羅 軍

(廣州廣紡聯(lián)集團有限公司，廣東 廣州 510655)

絲素蛋白具有良好的生物相容性、透氧性、生物可降解性，植入體內(nèi)后炎癥反應輕微[1]。因此，絲素蛋白被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥以及組織工程等多領域的研究，特別是在生物醫(yī)藥領域的研究成為了當今的熱點。絲素蛋白的天然形態(tài)是纖維狀，目前天然絲素蛋白纖維用作醫(yī)用縫合線已有幾十年的歷史[2]，對天然絲素纖維的再生加工是拓寬其應用領域的必要前提。由于靜電紡絲可以制備近似天然細胞外基質(zhì)結構的微納米纖維而成為一種熱點研究技術，通過靜電紡絲方法構建絲素生物醫(yī)用材料成為絲素研究和靜電紡絲研究的一個熱點交叉而受到廣泛關注。下面僅從不同紡絲溶劑的角度介紹靜電紡再生絲素蛋白微納米纖維材料及其在組織工程領域的研究進展。

1 六氟異丙醇(HFIP)作為溶劑

天然絲素蛋白由于其反平行β-折疊結構的存在導致其很難在一般溶劑中溶解。Zarkoob等[3]將家蠶絲素截成毫米級的小段放入無菌的瓶子中，采用HFIP作為溶劑在室溫下溶解五個月，然后用此溶液進行靜電紡絲。再生絲素膜纖維直徑6.5～100 nm，經(jīng)過高溫氮氣(150～300 ℃)處理發(fā)現(xiàn)纖維的結晶序列同天然纖維相似。Ohgo等[4]將家蠶再生絲素膜和脫膠蓖麻蠶絲溶解在HFA·3H2O中制成質(zhì)量分數(shù)為2%～10%的靜電紡絲溶液，靜電紡出纖維的直徑100～1 000 nm，并研究了材料的形態(tài)、結構和力學性能。Jeong等[5]將再生的絲素粉末溶解在HFIP中，制成質(zhì)量濃度為7 kg/m3的溶液，然后進行靜電紡絲。并研究了用水蒸氣，甲醇、乙醇、丙醇蒸氣誘導絲素結晶的過程。

Park等[6]將再生絲素蛋白和甲殼素按不同質(zhì)量比溶解在HFIP中制成混合溶液，在相同的條件下進行靜電紡絲，通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)隨著甲殼素含量的增加，纖維的直徑變細，這是由于隨著混合溶液中甲殼素的增加，溶液的電導率增加。另外在甲殼素/再生絲素蛋白(Chitin/RSF)共混納米纖維支架上培養(yǎng)正常人表皮角質(zhì)形成細胞(NHEK)和成纖維細胞(NHEF)，結果表明：在共混納米纖維支架中甲殼素質(zhì)量分數(shù)為75%、再生絲素蛋白的質(zhì)量分數(shù)為25%時，細胞在其上面增殖效果最好。Yoo等[7]進一步研究了Chitin/RSF共混納米纖維支架材料的生物相容性，并將其與Chitin/RSF混合納米纖維材料進行了對比，結果表明，混合纖維不如共混的好，混合纖維只有在絲素(SF)含量較高時生物相容性才好。Yeo等[8]則通過靜電紡絲得到直徑320～360 nm的膠原/再生絲素蛋白(Collegen/RSF)共混纖維。在其上培養(yǎng)人類角化細胞和成纖維細胞，并以Collegen/RSF混合纖維膜、純膠原纖維及純再生絲素蛋白纖維作對比。結果表明，人類成纖維細胞在共混纖維上的增殖黏附性能與在純膠原纖維及純再生絲素蛋白纖維上增殖黏附性能相似。人類角化細胞在共混纖維上的增殖黏附性能較在兩種純纖維材料上的增殖黏附性能有明顯的下降，但在Collegen/RSF混合纖維膜上增殖黏附性能卻明顯好于其在共混纖維膜上的增殖與黏附。

2 甲酸作為溶劑

雖然通過HFIP可以進行SF的靜電紡絲，所得材料支持細胞的黏附與生長，但存在一個重要的問題就是該溶劑十分昂貴，并不適合材料的加工使用。Kim等[9]報道了用甲酸作為再生絲素海綿膜的溶劑靜電紡絲。研究了靜電紡絲絲素膜的形態(tài)、空隙率和結構性質(zhì)。結果表明：再生的絲素納米纖維直徑為30～120 nm，壓汞法測定靜電紡絲素膜空隙率為76.1%。用體積分數(shù)為50%的甲醇溶液處理后靜電紡絲素膜在10 min之內(nèi)就迅速產(chǎn)生了β-折疊結構。Sukigara等[10]用甲酸作為溶劑溶解再生的多孔海綿膜，配制了質(zhì)量分數(shù)為5%～20%的溶液。他系統(tǒng)地研究了電場、極距、質(zhì)量分數(shù)對紡絲的影響，觀測了再生纖維膜的形態(tài)和纖維直徑。結果表明：紡出的纖維直徑在12～1 500 nm之間，溶液的質(zhì)量分數(shù)是靜電紡絲的最主要的影響因素，在質(zhì)量分數(shù)12%～15%、場強4 kV/cm能夠紡制出直徑小于100 nm的纖維。Sukigara等[11]在后續(xù)的研究中用表面響應法(RSM)優(yōu)化了靜電紡絲的參數(shù)。從RSM模型得出：質(zhì)量分數(shù)8%～10%、場強4～5 kV/cm、極距5～7 cm能得到直徑小于40 nm的纖維。Ayutsede等[12]在Sukigara的基礎上用FESEM觀察了纖維的形態(tài)，用RS、FTIR、XRD比較了生絲、脫膠絲、靜電紡絲膜的結構，同時也測試了再生纖維膜的機械性質(zhì)。研究結果表明：脫膠對絲蛋白二級結構沒有影響；溶解在氯化鈣溶液后結晶度有所提高；透析后由于除去了鈣離子結晶度降低；冷凍成干燥的海綿膜增加了分子內(nèi)氫鍵，結晶度有稍微的提高；海綿膜溶解在甲酸中，甲酸誘導產(chǎn)生了β-折疊結晶。隨后，Ayutsede等[13]以甲酸為溶劑，將碳納米管分散于再生絲素蛋白甲酸溶液中，同樣可以紡得形態(tài)較好的再生絲素蛋白/碳納米管復合納米纖維,最大斷裂強力為19.1 MPa、斷裂伸長5.8%。

Park 等[14]則將再生絲素蛋白和甲殼素按不同質(zhì)量比溶解在甲酸中制成混合溶液，在相同的條件下進行靜電紡絲，通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)隨著甲殼素質(zhì)量分數(shù)的增加，纖維的直徑變細，并且在后處理時SF的結構轉(zhuǎn)變也更快，但當甲殼素質(zhì)量分數(shù)超過40%時容易形成珠狀物。王曙東等[15]又通過靜電紡絲方法構建了纖維分布較均勻、具有較高孔隙率的絲素-明膠管狀支架(直徑為4.5 mm)，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)：細胞可以在支架上生長、增殖。Silva 等[16]在SF甲酸溶液中加入交聯(lián)劑京尼平，所紡纖維直徑增大，并且由于SF纖維中含有β-折疊結構而不溶于水。Min等[17]將再生SF膜溶解在體積分數(shù)為98%的甲酸中，制成質(zhì)量分數(shù)3%～15%的溶液靜電紡絲得到的絲素纖維膜的纖維平均直徑為80 nm。經(jīng)過體積分數(shù)50%的甲醇溶液處理60 min，膜的空隙率由76.1%下降至68.1%。細胞培養(yǎng)結果表明，靜電紡絲素膜可以促進人類角質(zhì)化細胞和成纖維細胞的黏附、增殖和遷移。Alessandrino等[18]將流延法制成的再生絲素膜溶于甲酸，制得不同濃度的溶液。研究了再生家蠶絲素溶液的最佳紡絲工藝參數(shù)，再生纖維膜的細胞毒性。結果表明：在質(zhì)量分數(shù)7.5%、電壓24 kV、推注速度3 mL/h、極距10 cm條件下，能夠制得外觀光滑均勻的纖維，纖維的平均直徑為(628±107)nm。SEM觀測顯示：L929細胞培養(yǎng)1天后就出現(xiàn)了黏附和增殖，7天后有細胞融合。Alamar blue測試表明：細胞的活性在靜電紡絲素膜和組織培養(yǎng)對照樣之間沒有明顯的區(qū)別。

3 水作為溶劑

雖然HFIP和甲酸都能夠進行SF的靜電紡絲，但是這兩種溶劑均有毒，其在材料內(nèi)的殘余勢必影響到材料在生物醫(yī)藥領域的應用。因此不采用有機溶劑的靜電紡絲更符合生物醫(yī)用材料的加工。 然而以水為溶液的靜電紡絲面臨以下幾個問題：絲素蛋白水溶液的濃度低、黏度小、水分揮發(fā)慢等。目前國內(nèi)外學者主要采用對SF水溶液進行濃縮、共混、加鹽三種方法來進行SF的水溶液靜電紡絲研究。Jin等[19]第一次報道了用絲素和聚氧化乙烯(PEO，分子質(zhì)量900 000)混合進行靜電紡絲。他將脫膠后的家蠶絲溶解在9.3 mol/L的LiBr溶液中，經(jīng)過透析得到質(zhì)量分數(shù)3.0%～7.2%的絲素溶液。然后將PEO按不同的比例直接加入絲素溶液中，制得質(zhì)量分數(shù)4.8%～8.8%的絲素/PEO溶液。紡出的絲素纖維的直徑(800±100) nm，F(xiàn)TIR表明靜電紡絲素/PEO膜沒有出現(xiàn)β-折疊結構，經(jīng)過體積分數(shù)90%甲醇溶液處理后，由無規(guī)卷曲向β-折疊轉(zhuǎn)變。PEO溶解去除后靜電紡絲膜的表面變得粗糙。杭怡春等[20]將SF水溶液濃縮到質(zhì)量分數(shù)20%，然后以100/0，90/10，85/15和75/25四種不同比例與30%的絲膠水溶液進行共混后紡絲，結果表明，隨著溶液中絲膠質(zhì)量分數(shù)的增加，體系的表觀黏度增大，靜電紡纖維的直徑減小且直徑分布變窄; 并且絲膠的存在有利于絲素蛋白從無規(guī)卷曲或α-螺旋結構向β-折疊結構轉(zhuǎn)變，由此可提高靜電紡纖維的力學性能。

Wang等[21]報道了直接用絲素水溶液進行靜電紡絲。絲素脫膠后，用9.5 mol/L的LiBr溶解、透析、過濾，然后濃縮至質(zhì)量分數(shù)17%～39%。當紡絲液的質(zhì)量分數(shù)28%、電壓20 kV、極距11 cm時可制得具有光滑表面的圓形再生絲，纖維的平均直徑700 nm。X衍射表明靜電紡再生絲素蛋白含有α-螺旋和β-折疊結構，其結構不同于無定形絲素膜，也不同于天然絲素纖維，介于兩者之間。Chen等[22]也報道了用絲素水溶液進行靜電紡絲，并且測定了再生絲素膜的機械性能。他將脫膠后的生絲溶解在三元溶液中，然后透析、過濾。在50～60 ℃下慢速攪拌濃縮絲素溶液至質(zhì)量分數(shù)28%、30%、32%和37%進行靜電紡絲。研究發(fā)現(xiàn)在紡絲液質(zhì)量分數(shù)達到30%時溶液黏度急劇增加，當紡絲液質(zhì)量分數(shù)為37%時，濃度過高致使注射器針頭的溶液很快就干燥。當紡絲液質(zhì)量分數(shù)達到34%、電壓20 kV、距離18 cm時，靜電紡絲的纖維呈條帶狀。FTIR、WAXD、DSC測試表明，再生的纖維構象以無規(guī)卷曲為主，經(jīng)體積分數(shù)90%甲醇處理后絲素結構轉(zhuǎn)向β-折疊。機械測試表明：再生靜電紡絲膜的斷裂強力為0.82 MPa、斷裂伸長0.76%；經(jīng)過甲醇處理后斷裂強力為1.49 MPa、斷裂伸長1.63%。Wang等[23]也采用了同軸靜電紡絲制備納米纖維的方法，用絲素作為內(nèi)層溶液，PEO作為外層溶液，紡出的纖維除去PEO就得到了較細的納米纖維。在靜電紡絲過程中沒有發(fā)現(xiàn)絲素/PEO的明顯混合。通過調(diào)整毛細管內(nèi)徑和外徑溶液的流速，可以得到一系列不同直徑的纖維，除去殼結構PEO后纖維最小直徑170 nm。并第一次把靜電紡絲素膜置于RH 90%、25 ℃環(huán)境中誘導結構轉(zhuǎn)變。放置72 h后，F(xiàn)TIR、XRD證實了絲素膜主要構象由無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)向β-折疊。

Zhu等[24]報道了調(diào)整再生絲素溶液pH值模擬蠶后部絲腺條件進行紡絲。把家蠶絲素脫膠，溶解在9.0 mol/L的LiBr溶液中，透析然后濃縮至質(zhì)量分數(shù)20%。在溶液中以1 ∶3(v/v)加入0.1 mol/L的檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液使pH值降至6.9，然后在10 ℃進一步濃縮至不同的濃度備用。用正交設計的方法研究了影響靜電紡絲的參數(shù)。Cao等[25]用家蠶絲經(jīng)脫膠，溶解在9.3 mol/L的LiBr溶液中，透析濃縮制得一系列濃度的再生絲素溶液。在濃縮的過程中加入LiBr或者NaCl、Na2HPO4調(diào)整紡絲溶液的導電性。研究表明：溶液質(zhì)量分數(shù)、導電性和施加的電場均影響纖維的形態(tài)。質(zhì)量分數(shù)從11%到17%都成功地紡出再生的絲素納米膜。在最優(yōu)的紡絲條件下(質(zhì)量分數(shù)13%、流速0.2 mL/h、場強1.35 kV/cm)，紡出的納米纖維膜經(jīng)過純乙醇處理斷裂強力(11.1± 0.7)MPa，斷裂伸長(10.2±1.6)%，顯示了良好的機械性能。

Jin等[26]采用質(zhì)量分數(shù)5.0%的PEO溶液與質(zhì)量分數(shù)8%的絲素溶液以4 ∶1(wt/wt)混合制得質(zhì)量分數(shù)7.5%的絲素/PEO溶液，進行靜電紡絲。用體積分數(shù)90%甲醇溶液處理10 min誘導產(chǎn)生β-折疊結構。在37 ℃下用水沖洗48 h除去PEO，培養(yǎng)人的骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)。研究結果表明：絲素/PEO纖維平均直徑(700±50) nm；甲醇處理后具有良好的機械性能，斷裂強力為(13.6±1.4) MPa、斷裂伸長(4.0±2.0)%；SEM和MTT測試表明，在細胞培養(yǎng)14天后，靜電紡絲膜極好的支持了BMSCs黏附、增殖。Zhang等[27]評估了靜電紡絲素支架用作血管組織工程的可行性。用質(zhì)量濃度7.5 kg/m3的絲素/PEO混合溶液靜電紡絲，用體積分數(shù)100%的甲醇處理誘導產(chǎn)生β-折疊結構，放在蒸餾水中72 h去除PEO。主動脈細胞(HAECs)和冠狀動脈平滑肌細胞(HCASMCs)被種植在再生的靜電紡絲支架上面。結果顯示：在種植HCASMCs 5天的時間內(nèi)，用掃描電鏡和共聚焦顯微鏡觀測到了細胞的排列和伸長。在第4天，HAECs在絲素支架上呈索帶狀分布，在第7天，HAECs形成了毛細管互聯(lián)的網(wǎng)狀結構和一些可辨認的管腔。這些都表明了血管類細胞和絲素支架之間良好的相容性。Soffer等[28]在Zhang的基礎上用靜電紡絲的方法制作了直徑為5 mm的絲素微管，用做血管移植，測試了管型材料的機械性能和生物相容性。結果顯示：管型支架的破裂強力為0.108～0.010 MPa，足夠承受動脈壓力。斷裂強力為(2.42±0.48) MPa，線性模量(2.45±0.47) MPa，機械性能與天然血管相似。支架材料很好地支持了血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的生長，這些都表明了靜電紡絲素支架材料在血管組織工程潛在的應用價值。Li等[29]以再生絲素蛋白水溶液靜電紡得到的納米纖維支架為材料，研究了人骨髓間質(zhì)干細胞(hMSCs)體外培養(yǎng)骨組織的形成，并在再生絲素蛋白中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)和羥基磷灰石納米顆粒(nHAP)，以考查其對骨組織形成的影響。通過將hMSCs在電紡的RSF/PEO、RSF/PEO(PEO浸出)、RSF/PEO/BMP-2、RSF/PEO/nHAP、RSF/PEO/BMP-2/nHAP五種納米纖維支架上于成骨介質(zhì)中靜態(tài)培養(yǎng)31天后，通過SEM的觀察、鈣含量測定、DNA含量測定以及轉(zhuǎn)錄水平的表征可以看出，靜電紡再生絲素蛋白基支架能促進hMSCs在其上生長和分化，其中在靜電紡再生絲素蛋白支架中同時加有BMP-2和nHAP兩種物質(zhì)后，支架明顯促進了骨組織的形成。

4 結 語

通過靜電紡絲方法可以制備出性能良好的再生絲素蛋白組織工程支架，該支架材料已經(jīng)顯示出支持多種細胞的黏附、鋪展、生長和增殖。相比于HFIP和甲酸等有毒溶劑，以水作為溶劑制備的電紡再生絲素蛋白支架會更有利于細胞在其上面生長、黏附，因為避免了有毒溶劑在支架材料中的殘留。因此以水為溶劑的靜電紡絲將會是SF靜電紡絲研究的主要方向。

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