CREB參與慢性應用嗎啡引起的神經(jīng)元和突觸的可塑性和適應性

李華 王麗

反復應用阿片類藥物，機體啟動適應機制，神經(jīng)元及突觸功能產(chǎn)生適應性改變，導致神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡功能發(fā)生長期改變，是機體形成藥物依賴和耐受的機制之一［1］。目前研究認為，阿片和其他成癮藥物具有共同的細胞和解剖通路，而受體后細胞、突觸和神經(jīng)網(wǎng)絡的適應性改變是成癮形成的關鍵［1］。阿片類藥物與其受體結合后，通過升高胞漿內(nèi)環(huán)磷酸腺普(cAMP)水平［2－4］和游離 Ca2+濃度(intracellular free Ca2+concentration，［Ca2+］i)［5－7］，分別激活 cAMP 依賴蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A，PKA)［2－4］及鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶(calmodulin-dependent kinase，CaMK)［8－10］，使轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的Ser-133磷酸化而激活CREB，從而持續(xù)調(diào)節(jié)其下游基因表達，參與神經(jīng)元與突觸的可塑性與適應性［2－4，8－10］。本文就 CREB 與阿片類物質(zhì)依賴與耐受形成的關系作一綜述。

1 CREB及其活性調(diào)節(jié)

1.1 CREB 作為多基因家族的一員，轉錄因子CREB主要通過cAMP反應元件(cAMP response element，CRE)介導cAMP和Ca2+依賴的基因表達。CRE由TGACGTCA序列組成，主要位于許多基因啟動子內(nèi)TATA盒上游100個核苷酸處［8］。CREB是由結構相關的蛋白組成的一個大家族CREB/ATF(activating transcription factor，ATF)中的一員，該家族與基因起動子內(nèi)的CRE結合。至少10種基因產(chǎn)物屬于CREB家族的一部分。通過不同的剪接，多數(shù)基因產(chǎn)生幾種異構體，從而使因子數(shù)目增大。例如，CREB基因產(chǎn)生3種主要的因子(α、β和δ)。除了轉錄激活因子，CREB家族還包括轉錄抑制因子。例如，cAMP反應元件調(diào)節(jié)因子(cAMP response element modulator，CREM)至少包括4種不同的抑制因子，分別為CREMα，β，γ和可誘導的cAMP早期抑制因子(inducible cAMP early repressor，ICER)，可阻斷CRE依賴的基因轉錄［8］。

1.2 CREB的活性調(diào)節(jié) 酶復雜的級聯(lián)反應調(diào)控CREB的活性。細胞外刺激通過升高細胞內(nèi)cAMP或游離Ca2+，在數(shù)分或數(shù)秒鐘后，CREB便被激活。隨著胞外刺激引起胞漿內(nèi)cAMP水平升高，PKA的催化和調(diào)節(jié)亞單位迅速分離，催化亞單位被動移位至細胞核，并在細胞受到刺激后15～20 min達到高峰。PKA導致CREB內(nèi)的PKA磷酸化位點(RRPSY)中Ser-133磷酸化。Ser-133磷酸化被認為是介導轉錄起始的關鍵事件，因為Ser-133突變?yōu)楸彼釋⑷∠D錄［8，11］。細胞內(nèi)Ca2+水平升高通過Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶Ⅳ(Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅣ，Ca2+/CaMKⅣ)使 Ser-133磷酸化而激活CREB。Ca2+激活CREB可能通過鈣調(diào)蛋白從胞漿移位到胞核。Ca2+調(diào)節(jié)的其他CREB激酶包括 p70 S6激酶(p70 S6 kinase，p70S6K)、p90 核糖體 S6 激酶(p90 ribosomal S6 kinase，p90RSK)家族成員和PKA。在體外，這些酶均可磷酸化CREB。在激活CREB時，這些激酶均位于細胞核內(nèi)。CREB的磷酸化狀態(tài)也受磷酸酶調(diào)節(jié)。在海馬神經(jīng)元，Ca2+/CaM通過激活calcineurin激活一種核磷酸酶，即蛋白磷酸酶-1(protein phosphatase-1，PP-1)，進而導致磷酸化 CREB(phosphorylated CREB，pCREB)去磷酸化［8－10］。在紋狀體，由多巴胺D1/D5受體誘導的pCREB的持續(xù)時間通過激活PP-1的抑制劑，即多巴胺和3＇，5＇-腺苷酸調(diào)節(jié)的磷蛋白(dopamine and adenosine 3＇，5＇-monophosphate-regulated phosphoprotein，DARPP-32)而得以延長［8］。

另外，CREB活性通過轉錄抑制因子而被抑制。例如，CREM α、β和γ，由于缺乏Q區(qū)域而不能與轉錄系統(tǒng)互相作用，從而通過CRE對cAMP依賴的基因轉錄起負調(diào)控作用。CREM類抑制因子可通過與CREB激活因子競爭與CRE的結合或通過與CREB激活因子結合形成無功能異二聚體，來發(fā)揮抑制作用。值得注意的是，CREB通過調(diào)控ICER抑制因子的激活，從而對其所調(diào)控基因的表達活性進行負反饋調(diào)節(jié)［8］。

1.3 CREB啟動基因轉錄的過程 CREB家族成員均包含亮氨酸拉鏈結構。這些蛋白通過并列的堿性氨基酸殘基發(fā)生二聚體化，形成識別特定寡核苷酸序列的DNA結合域。當CREB經(jīng)磷酸化激活形成pCREB時，pCREB便于特定的DNA序列CRE結合，從而啟動基因轉錄［8］。pCREB還可解除CREM類抑制因子的抑制作用［8］。

當CREB的Ser-133發(fā)生磷酸化形成pCREB時，pCREB便與一種轉錄共同激活蛋白，即CREB結合蛋白(CREB binding protein，CBP)或其同源類似物p300結合。CBP和p300均為包含多種蛋白與蛋白相互作用區(qū)域的大分子。在體外，CBP與轉錄因子TFⅡB相互作用，而CBP可能是RNA聚合酶Ⅱ全酶復合物的成分之一。另外，CBP是一種組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyl transferase，HAT)，并與 p300/CBP相關蛋白 P/CAF(p300/CBP-associated protein，P/CAF)結合，該蛋白也有 HAT活性。HAT催化組蛋白氨基末端的賴氨酸殘基發(fā)生乙?；?。乙酰化作用能中和介導DNA-組蛋白相互作用產(chǎn)生的電荷。CREB-CBP-P/CAF復合物誘導乙?；饔茫菇M蛋白-DNA的相互作用松弛，導致即刻早期基因(immediate early gene，IEG)啟動子上的轉錄起始復合物易于裝配。CREB與CBP的相互作用及隨后募集RNA聚合酶Ⅱ，對cAMP依賴的基因轉錄來說，尚不充分。啟動基因轉錄，仍需要其它成分，如TFⅡD［8］。

除了CRE需要CBP，其它的信號轉導通路也需要CBP。這些通路激活佛波醇酯元件(phorbol ester element，TRE)和血清反應元件(serum responsive element，SRE)，顯示CBP作為轉錄輔助激活因子，具有多種功能。

2 阿片依賴引起CREB經(jīng)磷酸化激活

2.1 阿片依賴引起神經(jīng)元內(nèi)cAMP升高 在慢性嗎啡依賴的動物試驗中，均可發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)cAMP水平明顯升高，與離體培養(yǎng)的原代神經(jīng)元和細胞株在受阿片類長時程作用的結果一致［11］。已知阿片受體均為具有7個跨膜片斷的G蛋白藕聯(lián)受體。這些G蛋白均為抑制型G蛋白(Gi和G0)［12－13］。慢性應用阿片類，配體與其結合后，抑制腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase，AC)的活性［12］。所以慢性應用嗎啡后細胞內(nèi)cAMP升高不是阿片類直接作用的結果，可能與細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加，從而選擇性上調(diào)對Ca2+敏感的Ⅷ型和Ⅰ型AC有關［12，13］。cAMP調(diào)節(jié)細胞眾多的功能，如細胞代謝、分泌、增生、分化、凋亡及誘導基因表達。在哺乳動物細胞中，cAMP通過PKA發(fā)揮作用。

2.2 阿片依賴引起神經(jīng)元內(nèi)游離濃度(［Ca2+］i)升高 細胞內(nèi)游離Ca2+作為第二信使參與細胞功能的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)元的信號轉導中起重要作用。慢性應用嗎啡，可導致［Ca2+］i升高［5－7，10］。Ca2+進入突觸后神經(jīng)元的胞漿，主要有四條通路:通過N-甲基-D-天冬氨酸型(N-methyl-D-aspartate-type)和α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate-type型谷氨酸受體;通過電壓門控Ca2+通道;通過細胞內(nèi)鈣庫釋放。

在電壓門控性鈣通道中，根據(jù)電導值、動力學特性等的不同，又分為幾種亞型，現(xiàn)知有L、T、N和P型。L型(long-lasting)開放時間久，約10～20 ms，表現(xiàn)為持續(xù)長時鈣內(nèi)流，電導值25 pS，激活電位－10 mV，失活電位 －60～－10 mV，衰變時間＞500 ms。T型(transient)的開放時間短暫，引起瞬間短小Ca2+電流，電導值9 pS，激活電位 －70 mV，失活電位－100～－60 mV，衰變時間20～50 ms。N型(neither L nor T)見于神經(jīng)元中，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，電導值13 pS，激活電位－10 mV，失活電位－100～－40 mV，衰變時間50～80 ms。P型最初在哺乳動物小腦浦肯野細胞中發(fā)現(xiàn)，故名，電導值隨條件不同變動為9 ～19 pS，激活電位 －50 mV，失活極慢，t1/2約1 s。

通過激活質(zhì)膜的電壓或配體門控鈣通道，導致細胞漿和細胞核內(nèi)Ca2+水平升高，激活CaMK。在體外，CaMKⅠ、Ⅱ和Ⅳ均能單獨使CREB的Ser-133發(fā)生磷酸化，CaMKⅣ則被認為在細胞內(nèi)起主要作用。CaMKⅣ位于細胞核內(nèi)［8，10］，其激活的動力學在時間上與CREB的Ser-133磷酸化和去磷酸化相關［9，10］。采用CaMKⅣ反義寡核苷酸或同源物遺傳重組，使CaMKⅣ失活，而降低激酶活性依賴的CREB的Ser-133磷酸化，表明CaMKⅣ是內(nèi)源性膜去極化激活CREB的激酶活性的重要部分。Ca2+內(nèi)流也引起Ras/MAPK信號通路激活，在激活核Rsk激酶時，Ca2+內(nèi)流達到高峰。在生長因子引起的信號轉導中，Rsk2被認為是第一個使CREB的Ser-133發(fā)生磷酸化的激酶。Rsk激酶也通過膜去極化激活，提示其可介導生長因子及Ca2+依賴的CREB磷酸化。對許多不同刺激，Ras/MAPK/Rsk和CaMK信號途徑的激活相同，提示這兩條通路在CREB的激活中可能起協(xié)同作用。根據(jù)CREB賴磷酸化的動力學分析顯示，在膜去極化后，CaMKs似乎控制CREB磷酸化的快速時相，而Ras/MAPK信號轉導途徑激活較慢，便成為以后時間內(nèi)主要的 CREB 激酶［8］。

3 CREB與神經(jīng)元和突觸的適應性

3.1 阿片依賴與與神經(jīng)元和突觸的適應性 阿片類引起機體穩(wěn)態(tài)重建，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂，從而產(chǎn)生阿片依賴。其中神經(jīng)元與突觸相應的適應性被認為起重要作用［1］。在大腦某一結構中，神經(jīng)元的可塑性與適應性表現(xiàn)為改變轉錄活性的刺激隨后可改變這一區(qū)域內(nèi)信息處理方式;在整體水平，可塑性與適應性導致個體與其周圍環(huán)境的相互作用發(fā)生改變，如學習、感知、理解及對環(huán)境刺激的行為反應發(fā)生改變［4］。

阿片藥物成癮的主要特征為耐受、戒斷綜合征及強迫用藥，而對其形成的生物學基礎尚未闡明［1］。目前認為，反復應用阿片類藥物，機體啟動適應機制，導致對阿片敏感的神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡的功能發(fā)生短期及長期改變。適應機制之一是耐受的形成，即為了獲得理想效果而需要愈來愈高的劑量。相關或條件耐受指應用嗎啡時，總是伴隨特定的環(huán)境，該環(huán)境在耐受形成中起重要作用，并在動物行為中由特定的神經(jīng)系統(tǒng)所介導。非相關或細胞耐受過程卻受到廣泛關注。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、分離組織和細胞中，有2種常見的非相關耐受，一種發(fā)生在阿片受體水平，此時效應器藕聯(lián)減少;另一種發(fā)生在細胞、突觸和神經(jīng)網(wǎng)絡水平，由于發(fā)生了反適應改變，盡管有持續(xù)的藥物活性，仍保持正常功能。反適應形成的另一結果是一旦停止用藥，將顯現(xiàn)一系列反跳癥狀和體征。這一戒斷綜合征具有持續(xù)短期、長期和很長時間的特征，包括在急性戒斷癥狀停止后的很長時間內(nèi)，對藥物的渴望和復吸［1］。慢性應用阿片類的結果，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)形成的最重要的適應，是從偶然用藥過渡到強迫用藥。耐受和戒斷確實參與了這一過程。慢性應用阿片類藥物造成的這些長期適應表現(xiàn)在無誘發(fā)藥物存在的情況下，提示特定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生了長期改變［1，13，14］。值得注意的是，神經(jīng)元和突觸適應過程形成的機制使人聯(lián)想到正常的突觸可塑性形成機制［1，15］。突觸可塑性(synaptic plasticity)指突觸功能強度的改變，這一過程通常是神經(jīng)生物學領域關于學習和記憶研究的主要焦點。突觸可塑性包括神經(jīng)傳遞強度或效力的短期改變以及突觸結構和數(shù)目的長期改變，如被認為是形成記憶的細胞基礎的突觸傳遞的長時程增強(longterm potentiation，LTP)及長時程減弱 (long-term depression，LTD)。分布在神經(jīng)元連接中的成千上萬的突觸強度的正向和負向調(diào)節(jié)，被認為是形成學習和記憶的物理和生化基礎。在低等動物中，包括蝸牛、果蠅和嚙齒類動物，對這些過程的細節(jié)已知曉很多。事實上，人腦和動物腦的區(qū)別是神經(jīng)元連接的數(shù)目和復雜程度，而不是基本的化學過程［16］。

導致阿片依賴的自發(fā)用藥和適應的生理機制代表病理記憶的類型。在細胞和突觸水平，LTP和LTD在濫用藥物誘導的突觸的適應與其它的活性依賴的可塑性中，其形成機制相同［1］。活性依賴的可塑性來自嗎啡對單個細胞的興奮性或遞質(zhì)釋放的直接效應。阿片的間接效應也同樣重要，例如，盡管海馬的錐體細胞不受阿片類的直接影響，但由于阿片對GABA中間神經(jīng)元的抑制而介導的抑制解除增加錐體細胞的興奮性，從而使一些形式的LTP易于形成。研究表明，在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)，突觸可塑性的分子機制與自發(fā)用藥直接相關［1］。

3.2 CREB參與神經(jīng)元和突觸的適應性 2000年諾貝爾獎獲得者Eric Kandel描述記憶過程為基因與突觸間的對話［16］。短時程記憶與突觸功能的暫時改變相關，該過程需要酶的激活及蛋白磷酸化，而無需新蛋白合成。長時程記憶則需要轉錄因子，如CREB等激活，啟動基因轉錄及合成新的蛋白質(zhì)，從而增強活化突觸的傳遞強度或數(shù)目，而參與突觸的可塑性過程。這一參與長時程記憶的分子機制在蝸牛、果蠅、嚙齒類和人類之間的過程相同。而CREB本身也被認為是參與長時程記憶的記憶分子［1，8，16］。

尋找與成癮有關的極其穩(wěn)定的分子適應機制所遇到的困難，與學習和記憶領域面對的挑戰(zhàn)相同［1，14］。盡管有成熟的學習和記憶的細胞和分子模型，但仍未確定足夠長期的細胞和分子適應機制以解釋高度穩(wěn)定的行為記憶?？赡艿臋C制之一是通過CREB介導很短暫的基因表達改變，而介導神經(jīng)元形態(tài)學和突觸結構的長期改變。例如，在海馬錐體神經(jīng)元，增加樹突突起的密度及LTP時谷氨酸能突觸的效力。另一種可能是轉錄因子CREB的短暫激活通過修飾染色質(zhì)，導致基因表達更持久的改變。CREB和許多其它的轉錄因子被認為通過促進靶基因周圍的組蛋白發(fā)生乙酰化或去乙?；せ罨蛞种瓢谢蜣D錄。盡管組蛋白乙?；蛉ヒ阴；l(fā)生非?？?，但是CREB在控制組蛋白乙?；拿赶到y(tǒng)方面產(chǎn)生更持久的適應。CREB也可能通過調(diào)節(jié)DNA或組蛋白的甲基化，使基因表達發(fā)生更持久的改變［14］。

綜上所述，在阿片類依賴和耐受形成中，CREB通過介導cAMP和Ca2+信號轉導而誘導靶基因表達，參與神經(jīng)元和突觸的適應性過程。由于CREB與CRE組成的復合物是多效性的激活劑，參與許多細胞及病毒的基因轉錄，而目前不清楚何種基因產(chǎn)物從核內(nèi)移位到特定的突觸，并通過何種機制參與神經(jīng)元與突觸的適應性過程［8］。也許從基因組范圍進一步分析，將更有益于理解當CREB發(fā)生改變時所導致的分子改變與濫用藥物所導致的行為反應之間的相關關系［3］。

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