胸苷酸合成酶多態(tài)性與非小細胞肺癌易感性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性研究

洪雷 崔雅靜 姜達 李琰 郭煒 王娜 張健慧

人類胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)是由兩個相同亞單位組成的二聚體蛋白，其基因定位于第18號染色體上(18p11.32)［1］。TS是DNA生物合成的關(guān)鍵酶，它催化單磷酸去氧尿苷(dUMP)甲基化，使之轉(zhuǎn)變?yōu)橐涣姿崦撗跣剀?dTMP)。TS活性的抑制將直接影響DNA的合成和細胞的分裂增值，因此TS是以葉酸為基礎(chǔ)的TS抑制劑化療中的一個理想靶點［2］。另外，胸苷酸合成反應(yīng)與蛋氨酸、葉酸代謝反應(yīng)偶聯(lián)，對DNA的甲基化和DNA的合成與修復(fù)有重要影響［3］。而個體的DNA甲基化水平以及DNA修復(fù)能力與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有明顯的相關(guān)性。許多研究表明TS的表達強度與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［2］。TS高表達者的增殖抗原表達、血管侵犯、遠隔轉(zhuǎn)移率明顯高于TS表達低者，因此TS高表達很可能對預(yù)測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展甚至遠處遷徙具有重要作用。本文通過采用PCR-RFLP技術(shù)，檢測研究對象的TS多態(tài)性基因型，探討TS基因多態(tài)性與非小細胞肺癌發(fā)生及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇病理診斷明確的非小細胞肺癌(NSCLC)患者177例作為NSCLC組。同時選擇同一醫(yī)院同一時期體檢人員381例作為對照組。2組患者均來自河北省南部非高發(fā)區(qū)并均為漢族。手術(shù)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移信息來自手術(shù)記錄。

1.2 標(biāo)本采集及DNA的提取 采集靜脈血5ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，置4℃保存，并于采血后1周內(nèi)，以蛋白酶K消化—飽和氯化鈉鹽析法提取外周血單核細胞DNA。

1.3 TS 5’UTR和3’UTR多態(tài)性位點基因分型 TS 5’UTR多態(tài)重復(fù)序列基因型檢測采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析方法進行。PCR反應(yīng)體積為25 μl，其中模板DNA100 ng，10×PCR緩沖液 2.5 μl，1.5 mmolmgCl2，1 U Taq-DNA 聚合酶，dNTPs 200 μmol，TS 5’UTR 上游引物 (5’-GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC-3’)和下游引物(5’-GGCTCCGAGCCGGCCACAGGCATGGCGCGG-3’)［4］各 200 nmol。PCR 反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性5min，然后94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán)后72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物進行3%的瓊脂糖凝膠電泳分析。預(yù)期2R、3R等位基因擴增產(chǎn)物分別為243 bp和215 bp。使用HaeIⅡ酶切對3R等位基因G→C SNP進行分型。酶切產(chǎn)物進行4% 的瓊脂糖電泳分析，含 66-，47-，45-，44-，28-和 13-bp 片段的為 3G 等位基因，含 94-，47-，45-，44-和 13-bp 片段的為 3C 等位基因。

TS 3’UTR 6 bp核苷酸片段的缺失或插入多態(tài)性分析采用PCR-RFLP 方法［5］。模板 DNA 100 ng，10 × PCR 緩沖液2.0 μl，1.5 mmolmgCl2，1 U Taq-DNA 聚合酶，dNTPs 200 μmol，TS 5’UTR上游引物(5’-CAAATCTGAGGGAGCTGAGT-3’)和下游引物 (5’-CAGATAAGTGGCAGTACAGA-3’)各 150 μmmol/L。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min，然后94°C 30 s，58°C 45 s，72°C 45 s，30個循環(huán)后，72°C 延伸 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DraⅠ于37°C消化12 h后，反應(yīng)產(chǎn)物進行3%的瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。有6 bp插入等位基因(6bp+)顯示70和88 bp片段，無6bp插入等位基因(6bp－)顯示152 bp片段。

每一組PCR反應(yīng)都做一個陰性對照，用去離子水代替DNA摸板進行擴增。隨機取10%的標(biāo)本重復(fù)PCR反應(yīng)來進行實驗的質(zhì)量控制。

1.4 DNA序列分析 對6個有代表性的標(biāo)本進行TS 5’UTR基因型測序。雜合型的標(biāo)本從瓊脂糖中切取相應(yīng)條帶后以DNA純化試劑盒進行純化，再行PCR擴增等位基因型產(chǎn)物。以ABI 377型測序儀行DNA序列測定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，經(jīng)比較各位點基因型頻率的觀察值與預(yù)期值并進行χ2檢驗，同時進行Hardy-Weinberg平衡分析，2組的基因型分布比較采用行×列表卡方檢驗，2組的單體型頻率計算及分布比較采用EH軟件(1.2 version，Rockefeller University，New York)進行，以非條件 Logistic回歸法計算表示相對風(fēng)險度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，頻率比較行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吸煙及家族史對NSCLC易感性的影響 NSCLC組吸煙者比例(59.9%)明顯高于健康組(39.9%)(P ＜0.01經(jīng)性別年齡調(diào)整 OR=2.24，95%CI=1.05～ 3.35)。家族史陽性者(14.7%)顯著高于對照組(4.6%)(χ2=8.62，P=0.003)。

2.2 對照組中TS基因多態(tài)性分布 TS 5’UTR基因分型結(jié)果顯示出4種 PCR 片段，約為210、240、270、300 bp。測序結(jié)果證實分別代表相同28 bp的2(2R)，3(3R)，4(4R)和5(5R)次重復(fù)等位基因，形成 2R/2R，2R/3R，3R/3R，2R/4R，3R/4R，2R/5R和3R/5R七種基因型。含有3R等位基因個體進一步分析G→C SNP，28bp重復(fù)序列多態(tài)和G→C SNP聯(lián)合確定TS 5’UTR多態(tài)性。對照組中5’UTR的等位基因頻率分別為33.7%(3G)，45.0%(3C)，20.4%(2R)和 0.9%(4R 和 5R);基因型頻率分別為 16.5%(3G/3G)，21.8%(3G/3C)，24.7%(3C/3C)，12.1%(2R/3G)，18.4%(2R/3C)和 4.7%(2R/2R)，其中2R/4R(0.3%)，3C/4R(0%)，2R/5R(0.5%)和 3R/5R(0)基因型在中國北方人口中出現(xiàn)頻率較少。TS 3’UTR 6bp缺失或插入基因型檢測:對照組中6bp－/6bp－、6bp+/6bp－和6bp+/6bp+基因型頻率分別為45.4%，45%和9.2%;6bp+和6bp－等位基因頻率分別為68.0%和32.0%。兩種TS多態(tài)性基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P ＞0.05)，在對照組中的基因型分布與年齡、性別、吸煙狀態(tài)無關(guān)。單倍體分析顯示6bp－/3C在正常對照中出現(xiàn)頻率最高(30.7%)，其他依次為 6bp －/3G(26.8%)，6bp+/3C(15.8%)，6bp+/2R(8.5%)，6bp － /2R(17.2%)，6bp+/3G(4.0%)。采用 EH軟件進行連鎖不平衡的分析結(jié)果顯示，與其他一些人口相同［5，6］，TS 5’UTR 和3’UTR 多態(tài)性在中國北方人口中存在明顯連鎖不平衡(D’=0.26，χ2=37.35，P ＜0.01)。6bp － 等位基因易與3R(3G或3C)等位基因連鎖。

2.3 NSCLC組與對照組中TS基因5’UTR和3’UTR基因型和等位基因型多態(tài)性分布比較 5’UTR和3’UTR的各基因型、等位基因型單獨分析在地2組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。但當(dāng)我們聯(lián)合TS 5’UTR和3’UTR基因型進行分析時發(fā)現(xiàn):同時攜帶3C/3C及6bp+/6bp+基因型的個體患NSCLC的危險性顯著低于攜帶其他基因型組合的個體(年齡、性別校正 OR=0.25，95%CI=0.06-0.95)。

2.4 TS單體型對NSCLC易感性的影響 單體型總體分布在NSCLC組中與對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。然而，6bp+/2R單體型在NSCLC患者組出現(xiàn)頻率(8.5%)顯著低于健康對照組(13.0%)(χ2=5.034，P=0.025)。6bp+/2R單倍體型顯著減低NSCLC的發(fā)病危險性(OR=0.5895 %CI=0.26～0.93)。

2.5 TS基因多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 在有腫瘤侵潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移資料的116例NSCLC患者中，未觀察到TS 5’UTR及3’UTR多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＞0.05)。

3 討論

TS基因是多態(tài)的，TS基因多態(tài)性與多種腫瘤的預(yù)后、化療敏感性甚至化療毒性相關(guān)。TS基因5’端轉(zhuǎn)錄啟始點上游存在一28 bp多態(tài)性重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)包括兩次(2R)、三次(3R)或更多次數(shù)［7］;Shintani Y 等［8］發(fā)現(xiàn)，在 70 例Ⅰ期和Ⅱ期非小細胞肺癌患者中，3R/3R基因型肺癌組織表達水平以及蛋白水平較2R/2R，2R/3R高。雖然迄今為止眾學(xué)者在TS5’端基因型是否與mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)的問題上還存在分歧［9，10］，但體內(nèi)外研究顯示，3R等位基因型的蛋白表達效率均高于2R［4，11］。在3R的第二次重復(fù)序列存在G→C的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)。含G的3R序列(3G)表達效率較含有C的3R序列和2R序列高3～4倍［12，13］。3G基因型與TS mRNA高表達有關(guān)［5］。另外，在TS mRNA3’非編碼區(qū)的1494b處存在6 bp核苷酸片段的缺失或插入［14］;報道顯示，6 bp缺失的等位基因型 (6bp－)在體內(nèi)減低mRNA的穩(wěn)定性，在體外使腫瘤細胞TS表達水平降低［6，15］。

NSCLC約占肺癌患者的80%，其中2/3的患者確診時已失去手術(shù)機會［16，17］。而且，傳統(tǒng)的診斷在方法上和診斷意義上還不能滿足我們臨床人員進行廣泛普查、早期診斷、臨床觀察和隨訪。因此，找到行而有效的早期診斷手段以及檢測綜合治療敏感與否的指標(biāo)是當(dāng)今NSCLC研究的一個重要課題。

吸煙可能會使血液中的B族維生素包括葉酸的水平降低，而低葉酸水平是引起DNA鏈斷裂，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定和癌癥風(fēng)險增加的關(guān)鍵因素［18］。而某一類人群易于受到某些有害物質(zhì)的侵擾患病，而把這種體質(zhì)傳給下一代，這種現(xiàn)象被稱之為遺傳易感性。雖說環(huán)境以及遺傳因素在肺癌發(fā)病過程中不是直接病因，但是它被認為是重要的促進因素。正如本研究結(jié)果，吸煙以及家族史陽性者患NSCLC的危險性明顯增加。

胸苷酸合成酶多態(tài)性基因與腫瘤易感性相關(guān)［19－22］。TS高表達的個體對腫瘤易感，而TS基因型多態(tài)性能夠影響TS蛋白表達和mRNA表達水平，因此TS基因型多態(tài)很有可能是我們評估腫瘤易感的重要指標(biāo)。但是我們的研究結(jié)果顯示，無論是5’UTR重復(fù)序列多態(tài)，SNP還是3’UTR插入或缺失多態(tài)都不單獨影響個體對NSCLC的易感性。然而當(dāng)我們聯(lián)合5’UTR和3’UTR多態(tài)性基因型進行分析發(fā)現(xiàn):與同時攜帶6bp－/6bp－/3G/3G基因型的個體相比，同時攜帶3C/3C及6bp+/6bp+基因型的個體患NSCLC的危險性要降低4倍。根據(jù)現(xiàn)有資料，3C單體型基因表達效率比3G單體型要低，而且目前多數(shù)認為6bp+單體型個體體內(nèi)TS mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達率要高于其他各基因型。TS活性增加可以給支氣管上皮細胞提供充足的核苷酸原料，加速支氣管上皮的新陳代謝，從而實現(xiàn)對支氣管上皮的保護作用，那么我們的結(jié)果是與目前大多數(shù)的研究結(jié)果是相吻合的。但是，當(dāng)分析TS單體型聯(lián)合作用與NSCLC易感性是否相關(guān)時，我們并沒有得到6bp+/3C單體型可以降低NSCLC發(fā)病危險性的預(yù)期結(jié)果，而發(fā)現(xiàn)6bp+/2R單體型在減少NSCLC發(fā)病危險上有顯著意義。6bp+/2R單體型包含一個引起TS低表達的2R等位基因和一個引起TS高表達的6bp+等位基因，而結(jié)果是顯著降低NSCLC發(fā)病危險性。我們考慮:(1)TS 5’UTR和3’UTR多態(tài)性聯(lián)合對TS轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響并不是一個簡單的加合作用，而且我們也很難用簡單的加減來解釋;(2)多態(tài)性基因型能否影響基因三維構(gòu)象從而影響基因功能尚需進一步探討;(3)環(huán)境-基因之間的相互作用非常復(fù)雜，它不是單基因的作用而是多基因的聯(lián)合作用;(4)當(dāng)然，這也有可能是由于樣本量小而出現(xiàn)的一個偶然結(jié)果，我們會加大樣本量進一步驗證;(5)進一步擴大樣本量，對不同病理類型進行分層分析的結(jié)果值得期待。另外，由于我們這項研究中因為缺乏組織標(biāo)本，因此未加入對TSmRNA轉(zhuǎn)錄及其穩(wěn)定性和蛋白表達的檢測。我們通過對116例由淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移資料患者TS多態(tài)的觀察，未發(fā)現(xiàn)TS 5’UTR及3’UTR多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＞0.05)，這與 Miyamoto等［22］的研究結(jié)果相符。

總之，TS 5’UTR重復(fù)序列多態(tài)性、SNP和3’UTR缺失多態(tài)性聯(lián)合分析可作為預(yù)測NSCLC易感性的標(biāo)志，而TS 5’UTR及3’UTR多態(tài)性與中國北方人群肺非小細胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

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