轉(zhuǎn)基因植物對環(huán)境微生物的影響及其檢測技術的研究進展

昌艷萍，楊亮，李春青，王華芳

（1.北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京 100083；2.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

轉(zhuǎn)基因植物對環(huán)境微生物的影響及其檢測技術的研究進展

昌艷萍1，2，楊亮1，李春青2，王華芳1

（1.北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京 100083；2.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

為了解轉(zhuǎn)基因植物及其表達產(chǎn)物環(huán)境釋放的生態(tài)影響，歸納和總結(jié)了轉(zhuǎn)基因植物對微生物的影響及其檢測技術的應用現(xiàn)狀.從轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物多樣性的影響及其檢測的一般方法和分子生物學方法，轉(zhuǎn)基因植物中抗性標記基因?qū)ξ⑸镉绊懞臀⑸镌谵D(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品毒理學檢測等方面進行了綜述，以期為轉(zhuǎn)基因植物的應用和健康發(fā)展提供依據(jù)，同時也為轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價研究提供借鑒.

轉(zhuǎn)基因植物；生物安全；毒理性；土壤微生物；檢測技術

轉(zhuǎn)基因植物中包含有來源于不同物種的基因，可以表達出新的性狀，使轉(zhuǎn)基因生物體特別是農(nóng)作物具有某些特定的功能和應用的商業(yè)價值［1-2］.轉(zhuǎn)基因植物的成功是人類改造自然的一個標志性成果，但是轉(zhuǎn)基因生物的實際應用和釋放帶來的安全性隱患，尤其對于生態(tài)系統(tǒng)的影響，還是一個認識并不透徹的方面.目前，人們付出了很大努力對轉(zhuǎn)基因作物地上部分的環(huán)境生態(tài)效應進行了評估，也取得了一些進展，但在轉(zhuǎn)基因作物及其工程菌對土壤微生物群落和活性的影響方面，則研究工作相對較少，主要原因之一是研究土壤微生物存在更大的困難.土壤微生物對土壤營養(yǎng)固定與礦化，有機質(zhì)的物理和生化降解，對環(huán)境狀況的反應變化的敏感特性，使其可作為一個地區(qū)或歷史環(huán)境變遷的生物指標，另一方面，轉(zhuǎn)基因植物及其表達產(chǎn)物和工程菌對土壤微生物群落影響的生態(tài)安全研究也是轉(zhuǎn)基因植物投放市場風險性評估最重要的內(nèi)容之一.

微生物種類繁多，生長繁殖快，代謝能力強，對環(huán)境影響敏感，與其他生物具有同一套遺傳密碼，這些特性決定了微生物是環(huán)境中最敏感的指示生物之一，其檢測技術簡便快速并且可行.本文總結(jié)了轉(zhuǎn)基因植物對土壤環(huán)境中微生物的影響及其檢測技術的研究進展，對推進我國轉(zhuǎn)基因植物的健康、可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實意義.

1 轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物種類和數(shù)量的影響及其檢測

轉(zhuǎn)基因植物在生長過程中和土壤進行著頻繁的物質(zhì)交換，加上轉(zhuǎn)基因植物的分泌產(chǎn)物不斷改變周圍特別是土壤環(huán)境的養(yǎng)分、水分、p H、通氣狀況及氧化還原電位，從而對轉(zhuǎn)基因植物根際范圍內(nèi)土壤的生物地球化學循環(huán)產(chǎn)生了重要影響.這種影響對土壤微生態(tài)的影響尚未引起足夠的重視，主要是土壤微生物研究存在較大的困難.土壤微生物數(shù)量巨大，種類繁多，一直被認為是研究中的黑匣子（black box）［3］.其中，土壤中的細菌和真菌在生物地球化學循環(huán)（biogeochemicalcycles，BGC）過程中扮演著非常重要的角色，而且對土壤中有機物質(zhì)的轉(zhuǎn)換也起著至關重要的作用［4］.轉(zhuǎn)基因作物對土壤生物的影響不僅包括外源基因本身，還包括外源基因所表達的產(chǎn)物及次級代謝產(chǎn)物等［5］.因此，土壤微生物成為轉(zhuǎn)基因作物釋放后生態(tài)風險性評價的重點對象.

1.1 對土壤微生物多樣性影響的直接測定

直接測定土壤微生物多樣性，就是利用光學和電子顯微系統(tǒng)對土壤樣品中的微生物測定絲狀微生物的長度或直接測定并計算微生物數(shù)目，其結(jié)果可以換算成單位面積微生物數(shù)目來表示，以此來統(tǒng)計生物量.通過轉(zhuǎn)基因植物及其對照親本影響范圍內(nèi)的微生物生物量的差異來初步了解轉(zhuǎn)基因林木對土壤微生物種類和數(shù)量的影響.這種方法只需要取少量的樣品，簡單直接，但與微生物所影響的整個資源環(huán)境相比，少量樣品并不能代表整個自然環(huán)境.

1.2 對土壤微生物多樣性影響的平板培養(yǎng)方法

另一種傳統(tǒng)的微生物多樣性群落分析是平板培養(yǎng)方法，其原理是每個活菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下生長形成肉眼可見的菌落.首先對待測樣品進行適當?shù)南♂?，以便每一個平板上只能生長一定合適數(shù)目的微生物群落，通過特定的表現(xiàn)型或者生物化學性狀來分析微生物的多樣性.

Oger等［6］對轉(zhuǎn)基因植物對根際細菌的影響進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物可改變根際細菌的生物學環(huán)境.王洪興等［7］的研究表明，在好氣條件下，添加克螟稻秸稈土壤中的細菌數(shù)量和反硝化細菌的活性明顯低于添加非轉(zhuǎn)基因親本秸稈的土壤；而對真菌的影響則反之.吳偉祥［8］研究也表明，添加克螟稻秸桿的土壤中的真菌數(shù)量，在培養(yǎng)后期明顯低于添加非轉(zhuǎn)基因親本秸稈的土壤的相應微生物數(shù)量.另一方面，根際分泌物也長期對根際生物起重要影響，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生大量的枯枝落葉.錢迎倩等［9］報道，帶有幾丁質(zhì)酶的抗真菌的轉(zhuǎn)基因作物可通過殘枝落葉的降解和根系分泌物減少土壤中菌根的種群.對轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株根系周圍微生物進行了比較，胡建軍等［10］初步證明楊樹轉(zhuǎn)基因植株未對微生物3大類群的數(shù)量有顯著影響.

1.3 對土壤微生物檢測的BIOLOG鑒定系統(tǒng)

平板上肉眼計數(shù)的分類技術檢測到環(huán)境樣品中的只是一小部分微生物，而土壤環(huán)境中微生物功能多樣性信息對于明確轉(zhuǎn)基因植物土壤環(huán)境中微生物群落的作用具有重要意義，從而使得微生物群落的定量描述成為微生物學家面臨的另一最艱巨的任務.一種更為簡單、更為快速定量分析描述微生物群落功能多樣性的方法是以BIOLOG微孔板碳源利用為基礎的鑒定方法.該方法由美國的BIOLOG公司于1989年開發(fā)成功，并最初應用于純種微生物鑒定.根據(jù)微生物對單一碳源底物的利用能力的差異，當接種菌懸液時，使孔中的氧化反應指示劑四氮唑紫呈現(xiàn)不同程度的紫色，說明其中的一些孔中的營養(yǎng)物質(zhì)被利用，這樣構(gòu)成了該微生物的特定指紋.劉穎［11］運用BIOLOG法，分析了轉(zhuǎn)基因棉花土壤根際微生物對31種碳底物代謝反應的平均顏色反應（AWCD）值，結(jié)果表明：在棉花2葉和5葉期，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的根際土壤微生物在代謝特征上與非轉(zhuǎn)基因棉的根際土壤微生物產(chǎn)生了較大差異，轉(zhuǎn)基因棉根際微生物的生理代謝能力明顯高于非轉(zhuǎn)基因棉根際微生物；但在11葉期，這種差異性變小.楊永華及姚建［12］利用BIOLOG微平板研究農(nóng)藥污染對微生物群落的影響，也獲得了較好的預期效果.

2 鑒定轉(zhuǎn)基因植物對微生物多樣性影響的分子生物學方法

在自然界存在的微生物中，已為人們所認識的僅占很少一部分，能夠在實驗室培養(yǎng)的種類則更少，至多為1%.其中的原因就在于大多數(shù)自然環(huán)境中的微生物難于或者不能模擬其生長繁殖的真實條件而無法獲得純培養(yǎng).20世紀70年代以來，DNA重組技術及基于對RNA序列分析的生物分子系統(tǒng)進化理論的建立，使人們可能在不進行培養(yǎng)的情況下研究微生物.一些分子生物學技術已用于微生物生態(tài)的研究，通過從基因水平探索微生物群落的均勻度、豐度、分析菌種的變異情況等，為全面認識微生物多樣性在生態(tài)系統(tǒng)中的原始構(gòu)成提供了行之有效的技術手段.

1983年Fisher和Lerman［13］首次將變性梯度凝膠電泳技術（DGGE）引入微生物生態(tài)學研究中，變性梯度凝膠電泳了16S r DNA PCR擴增后的片段，確定了環(huán)境中微生物群體的遺傳多樣性，分析了環(huán)境中微生物區(qū)域的變化.該方法的原理是使用1對特異引物，PCR擴增16S r DNA片段，然后利用DGGE分離產(chǎn)物混合物.由于變性劑濃度以及產(chǎn)物序列的不同，結(jié)果不同的產(chǎn)物在凝膠上分離開來.變性梯度凝膠電泳技術不僅能鑒別樣品中可培養(yǎng)的微生物的類別，而且還能鑒定不可培養(yǎng)的類別，樣品檢測速度快，避免了對多個無遺傳差別或差別很小的菌株重復進行繁瑣的各種表觀特征研究，從而大大降低了工作量，結(jié)果準確可靠，同時分析得到的譜帶，有助于人們高效地進行各種環(huán)境樣品中微生物的優(yōu)勢菌的分離和優(yōu)勢群落鑒定.

利用PCR-DGGE指紋圖譜和主成分分析（PCA）技術，任馨等［14］研究了抗蟲水稻Bt基因表達量最高期秸桿和同一時期非轉(zhuǎn)基因親本水稻秸桿的添加對淹水土壤可培養(yǎng)厭氧細菌數(shù)量和細菌群落組成的影響.采用類似的方法，王洪興等［7］研究了Bt水稻及其親本秸桿在降解過程中對土壤微生物主要類群的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親本對照相比，Bt水稻秸桿的添加明顯地增加了細菌和真菌的數(shù)量，而放線菌和反硝化細菌明顯降低.

另一種DNA分子水平上的多態(tài)性檢測是RFLP技術，它是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、探針-雜交和印跡技術的綜合應用.利用PCR-RFLP指紋圖譜、克隆文庫和測序等方法，段思蒙等［15］比較全面、準確地了解桉樹人工林土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)，和采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得出的結(jié)論不同的是，16S rDNA測序結(jié)果表明，桉樹人工林土壤細菌在分類方面主要屬于Acidobacteria和Proteobacteria，桉樹人工林土壤細菌種類豐富，細菌群落結(jié)構(gòu)較復雜.

較為成熟的分子生物學技術還有單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）、16S rDNA文庫構(gòu)建、熒光原位雜交（FISH）、隨機擴增多態(tài)性（RAPD）等，可以在土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)研究中應用［16］.或者操作者根據(jù)自己的實際情況將上面的幾種方法結(jié)合檢測微生物群落的多樣性變化，從而判斷和評價轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境生態(tài)風險性.

Fang等［17］通過DGGE和Biolog分子生物學方法研究了轉(zhuǎn)Bt基因玉米桔稈還田對土壤微生物的影響，結(jié)果均表明轉(zhuǎn)Bt基因玉米顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu).應用DGGE和T-RFLP分子生物學技術，Liu等［18］通過3年的田間試驗，檢測了轉(zhuǎn)Bt基因和非轉(zhuǎn)基因水稻根際細菌、真菌群落多樣性，水稻生育期顯著影響了根際微生物多樣性，但是Cry1Ab基因?qū)雽毦?、真菌并無顯著性影響.

3 轉(zhuǎn)基因植物中抗性標記基因?qū)ξ⑸锏挠绊懠捌錂z測

2004年，Heritage［19］報道，一些腸道微生物在人工培養(yǎng)條件下的生長情況與正常的不同，說明這些微生物可能獲得并含有轉(zhuǎn)基因作物的基因，即可能發(fā)生了基因轉(zhuǎn)移.抗生素抗性基因已成為轉(zhuǎn)基因植物中常用的標記基因，選擇標記基因的安全性應與轉(zhuǎn)化的目標基因一樣進行全面評價.Hoffmann等［20］證實轉(zhuǎn)基因油菜、黑芥菜、蒺藜和甜豌豆中抗生素基因可以轉(zhuǎn)移到黑曲霉中.在作物遺傳轉(zhuǎn)化操作過程中，大多采用如hpt和npt II基因作為抗生素選擇標記基因，用于轉(zhuǎn)基因植株的篩選.

雖然有關抗生素選擇標記基因nptII及其表達產(chǎn)物的食品安全性評價已有較多的文獻報道［5，21-23］，而對如hpt和npt II基因及其表達產(chǎn)物的環(huán)境安全性評價研究，尤其是它們在轉(zhuǎn)基因作物中的表達、根際環(huán)境中的殘留規(guī)律和根系分泌等，至今鮮見報道.Gebhard等［24］研究指出插入轉(zhuǎn)基因甜菜中卡拉霉素抗性基因能夠轉(zhuǎn)化Ascinetobactersp.，使這種細菌獲得卡拉霉素抗性，從而證明了基因可以在不同物種之間轉(zhuǎn)移的可能性.

4 轉(zhuǎn)基因植物中目的基因的自然遺傳轉(zhuǎn)化

遺傳轉(zhuǎn)化是指同源或異源的游離DNA分子被自然或人工感受態(tài)細胞攝取，并得到表達的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程.DNA是否能發(fā)生自然轉(zhuǎn)化，主要取決于環(huán)境中是否存在具有轉(zhuǎn)化活性的DNA分子及可吸收DNA的感受態(tài)細胞.DNA分子可與固形物（土壤、沙粒子）結(jié)合而得到保護，免受DNase的降解，從而能長時間存留于環(huán)境中并具有轉(zhuǎn)化活性.同時，自然感受態(tài)作為許多細菌應對不利生活條件的一種調(diào)節(jié)機制，在自然環(huán)境中的存在具有普遍性.

重組DNA分子可能發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的，進入到其他組織或生物體中.Mercer等［25］發(fā)現(xiàn)人類唾液中的外源質(zhì)粒DNA能轉(zhuǎn)化自然活化的StreptococcusgordioniiDL1細菌，由此說明外源基因具有轉(zhuǎn)化微生物的可能性.這樣，轉(zhuǎn)基因原料中的外源DNA片斷是否會因為自然界的基因重組等遺傳過程發(fā)生基因逃逸也是轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放時檢測中不得不考慮的重要方面.

因此，轉(zhuǎn)基因植物進入生產(chǎn)性實驗前檢測外源基因在自然條件下能否通過土壤微生物發(fā)生轉(zhuǎn)移具有重要意義.基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象在原核生物中普遍存在，在真核生物中近年來也發(fā)現(xiàn)了眾多例證，說明基因水平轉(zhuǎn)移是生物界的普遍現(xiàn)象［26］.植物的落葉、花粉和果實等使土壤中存在大量DNA，并能保留很長時間.外源基因，尤其是抗性基因的水平轉(zhuǎn)移可能改變細菌的基因組DNA，甚至影響該群落的進化方向.

5 微生物在轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)物毒理學檢測中的應用

轉(zhuǎn)化的基因可能產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物，這種物質(zhì)有可能是毒素或過敏原，這樣就需要隨時將相關工作歸入更高或更低的生物安全水平.轉(zhuǎn)基因植物的毒性評價除了常規(guī)的通過外源基因編碼蛋白的化學組成判斷其毒性和采用動物實驗或模擬實驗的方法評判外源基因編碼蛋白的毒性以外，還可以通過更為簡單的微生物檢測來對轉(zhuǎn)基因植物的毒理安全性進行初步評估.

有毒產(chǎn)品接觸微生物后，可造成細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性和細胞膜破裂從而導致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏或遺傳物質(zhì)破壞，從而對微生物造成毒性危害.用適當?shù)闹笜税堰@些危害效應反映出來，就能對測試品的毒性程度和濃度大小作出評價.轉(zhuǎn)基因食品的毒理學評價，如免疫毒性、神經(jīng)毒性、致癌性、繁殖毒性以及是否有過敏源等是安全性評價的重要內(nèi)容之一［27］.

5.1 遺傳毒性實驗

Ames等［28］經(jīng)十余年努力，于1975年建立并不斷發(fā)展完善的沙門氏菌回復突變實驗（亦稱Ames實驗），是被公認為權(quán)威的遺傳毒性實驗之一.它用于衡量受試品是否具有致突變性，而有研究表明90%的致突變可引起癌癥.有的物質(zhì)是潛在誘變劑，經(jīng)動物體內(nèi)肝微粒體酶的轉(zhuǎn)化才能變?yōu)檎T變劑，因此Ames等［29］人又在原有檢測過程中加入大鼠肝臟提取液（S9混合液）以提高檢測的準確性.誘變性與物質(zhì)毒性之間存在明顯的相關性，即物質(zhì)毒性越強，誘變能力就越強.

當前轉(zhuǎn)基因植物毒理安全性評價主要集中在水稻、玉米等糧食作物，薛大偉等［30］通過Ames實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)抗除草劑基因（bar）水稻屬實際毒性極微或無毒類物質(zhì)，被測物對4種突變株沒有明顯的誘導突變作用.

借鑒于Ames實驗原理以及參考轉(zhuǎn)基因食品的檢測評價，可以將轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物的各組織的提取液進行Ames實驗以初步確定植物表達產(chǎn)物的遺傳毒性.艾姆斯實驗靈敏度高，可在48 h迅速得出結(jié)果，費用較低，仍不失為一種較好的初篩方法，應該成為轉(zhuǎn)基因植物的毒性評價考慮的重要方面.

5.2 細菌發(fā)光檢測

發(fā)光細菌中的FMNH2和醛類在胞內(nèi)熒光素酶催化作用下，氧化生成FMN、酸和水，釋放出肉眼可見的藍綠色熒光.當環(huán)境條件不良或有毒物質(zhì)存在時，發(fā)光能力受到影響而減弱，其減弱程度與毒物的毒性大小和濃度成一定的比例關系.

另外，發(fā)光細菌本身沒有危害性，所以利用發(fā)光細菌的發(fā)光強度作為敏感的指標物來監(jiān)測有毒物質(zhì)，在國內(nèi)外越來越受到重視［31］.自美國20世紀70年代首次分離到Photobacteriumphsphoreum細菌并用于污水生物監(jiān)測獲得成功以來，細菌發(fā)光檢測取得較大發(fā)展，成功用于多種類型污染物的監(jiān)測.歐美國家已經(jīng)開始利用發(fā)光分析來進行食物中金屬毒物的快速檢測，并已經(jīng)進行了大量的研究應用，我國于1995年將這一方法列為環(huán)境毒性檢測的標準方法（GB／T15441—1995）.

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品毒理性的微生物檢測還有生長抑制實驗，是快速評價化合物對微生物毒理效應中較為常用的另一方法.微生物呼吸代謝檢測，細菌生長抑制、呼吸代謝速率或菌落數(shù)檢測，生態(tài)效應檢測是另外3大類型的微生物檢測.上述各種環(huán)境毒物檢測方法，都具有一定的局限性，故在實際工作中，通常都采用2種或2種以上的方法，以便進行綜合分析和比較.

轉(zhuǎn)基因植物對環(huán)境生態(tài)安全的影響是一個長期而復雜的過程，且需要個案分析，應該以田間試驗為準.目前還沒有公認的評估和檢測轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全性的方法和標準，本文只是從微生物的變化結(jié)果來指導轉(zhuǎn)基因植物目的基因通過微生物水平轉(zhuǎn)移的可能性，從微生物數(shù)量和種類的變化來推測轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放的可能性，轉(zhuǎn)基因植物對環(huán)境微生物多樣性的影響，轉(zhuǎn)基因植物及其表達產(chǎn)物的毒理性等，希望能對轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境釋放和生態(tài)安全評價起到拋磚引玉的作用.對于具體的轉(zhuǎn)基因植物，今后仍需嘗試用更精確的方法嚴格地檢測實驗轉(zhuǎn)基因植物對生態(tài)系統(tǒng)各方面的影響.

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Progress on Influence of Genetically Modified Plant on the Microorganisms in Environment and Their Detection Technology

CHANG Yan-ping1，2，YANG Liang1，LI Chun-qing2，WANG Hua-fang1
（1.College of Biological Science and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

To comprehend the ecological effect of transgenic plant and derived products in the environment，influence of genetically modified plant on the microorganisms in environment and status of their detection technology were generalized.The summary reviewed including conventional methods and molecular methods for examination edaphon diversity，impact of the resistant mark gene in genetically modified plant organisms，and application in microbial toxicology examination of transgenic plants and their derived products.It was also predicted to provide the basis for the development and application，and offer research reference material for the safety assessment of transgenic plants.

transgenic plant；biosafety；toxicological；soil microorganism；detecting technique

Q 938

A

1000-1565（2011）03-0331-06

2010-09-01

國家公益林項目（200704017）；國家“948”項目；國家“863”項目（2004AA244040；2006AA10Z18 2）

昌艷萍（1969-），女，湖北仙桃人，河北大學副教授，北京林業(yè)大學在讀博士，主要從事生物技術研究.

王華芳（1956-），男，云南石屏人，北京林業(yè)大學教授，博士研究生導師，主要從事植物生物技術方面的研究.

E-mail：470978883＠qq.com

趙藏賞）