響應(yīng)曲面法優(yōu)化木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性能工藝

涂勇剛，聶旭亮，徐明生，孫春妹，杜華英，趙 燕，董 攀

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江西 南昌 3 30045；3.南昌大學(xué)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性能工藝

涂勇剛1，聶旭亮2，徐明生1，孫春妹1，杜華英1，趙 燕3，董 攀3

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江西 南昌 3 30045；3.南昌大學(xué)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047)

優(yōu)化木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性能的工藝。在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定自變量酶解時間、木瓜蛋白酶添加量、酶解溫度、pH值的試驗水平，以起泡性和泡沫穩(wěn)定性為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法，研究各自變量及其交互作用對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響。然后利用Design Expert軟件進行響應(yīng)面分析，模擬得到二次多項式回歸方程的預(yù)測模型，并確定蛋清蛋白酶改性的最佳條件組合。結(jié)果表明：蛋清蛋白泡沫穩(wěn)定性酶解模型不顯著，而起泡性酶解模型顯著，在最佳工藝參數(shù)酶解時間45min、酶添加量38.2mg/5mL蛋清、酶解溫度47.5℃、pH6.3的條件下，蛋白起泡性可達2.09，此條件下可使蛋清蛋白起泡性提高140%左右。

蛋清蛋白；木瓜蛋白酶；起泡性；泡沫穩(wěn)定性；響應(yīng)曲面法

蛋清中的蛋白質(zhì)含量為11%～13%[1]，是蛋清的主要組成成分。一直以來，蛋清蛋白因其極高的營養(yǎng)價值和其他食品原料所不可比擬的高起泡性能被廣泛地應(yīng)用于蛋糕、面包、冰淇淋粉、冷飲、餅干、飲料等食品的加工中[2-4]。影響蛋清蛋白起泡性能的因素包括溫度、pH值、儲藏時間、打蛋時間、金屬離子和添加劑等，蛋雞的年齡和產(chǎn)蛋季節(jié)也對蛋清蛋白的起泡性有一定的影響[1,5]。為穩(wěn)定和提高蛋清蛋白的起泡性能，人們嘗試用物理法(如：熱處理[5-6]、超高壓[4-5])、化學(xué)法[7]和酶法[3,5]對蛋清蛋白進行改性，使其獲得較好的起泡特性。

蛋白質(zhì)分子經(jīng)酶水解后可在其表面形成較大的疏水區(qū)域，易于吸附在氣泡膜表面，有利于增加泡沫的穩(wěn)定性。有報道[8]稱對大豆蛋白進行適度的酶水解可以提高其起泡能力，Were等[9]采用木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白，在中性條件下，改性后的大豆分離蛋白的起泡性相當(dāng)于雞蛋蛋白的起泡性。李鵬等[10]用纖維素酶酶解花生蛋白以提高其起泡性。目前，酶水解改性提高蛋白質(zhì)起泡性的研究在植物蛋白領(lǐng)域較多，對蛋清蛋白研究較少。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，采用木瓜蛋白酶酶解蛋清蛋白以改善其起泡性能，對木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白的工藝中的幾種影響因素進行研究，并采用響應(yīng)曲面法確定木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白的最佳工藝參數(shù)，為高起泡性蛋清蛋白粉的生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋 市購。

木瓜蛋白酶 上海藍季科技發(fā)展有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T25-25G型分散機 上海昂尼儀器儀表有限公司；SL2002N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；HH-6型水浴鍋 常州國華電器有限公司；BS224S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHB-1筆型pH計 上海宇隆儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清蛋白的制備

選取新鮮雞蛋，除去蛋殼和蛋黃，將蛋清放入500mL燒杯中攪拌均勻，備用。

1.3.2 蛋清蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

[11-13]進行，略有修改。具體方法如下：起泡性的測定：在一定溫度條件下，用0.2mol/L、pH7磷酸緩沖溶液配制體積分?jǐn)?shù)5%蛋白液100mL于250mL的燒杯中，然后用分散機在9500r/min條件下攪打3min，然后立即記錄燒杯中泡沫的高度并轉(zhuǎn)換成泡沫的體積(V0)；泡沫穩(wěn)定性測定：將上述泡沫體系在室溫條件下放置30min，讀出液體的體積(V1)。

1.3.3 單因素試驗

在250mL燒杯加入一定量的木瓜蛋白酶，再加入95mL pH7.0的緩沖溶液，使其溶解后加入5mL蛋清蛋白攪拌均勻，調(diào)節(jié)一定pH值后將燒杯放入一定溫度的水浴鍋中酶解一定時間后分別測定其起泡性和泡沫穩(wěn)定性。以起泡性和泡沫穩(wěn)定性為指標(biāo)，選擇酶解時間、木瓜蛋白酶的添加量、酶解溫度、p H值進行單因素試驗。

1.3.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法B o x-Behnken設(shè)計優(yōu)化試驗，確定3個水平編碼表。結(jié)果采用Design-Expert 6.0.5進行試驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解時間對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，木瓜蛋白酶酶解時間對蛋清蛋白起泡性的影響呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在30min時起泡性達到最高點；在180min內(nèi)酶解時間對蛋白泡沫穩(wěn)定性影響不大(P＞0.05)，180min以后隨著時間的延長蛋清蛋白泡沫穩(wěn)定性先增大后減小，在240min時泡沫穩(wěn)定性最好(P＜0.05)?？傮w而言，與酶解初期相比，蛋清蛋白的起泡能力增加較明顯，泡沫穩(wěn)定性變化不大。這可能是由于水解后蛋白質(zhì)的平均分子質(zhì)量降低、表面疏水性和分子的柔性增加，使得酶法改性后的蛋清蛋白分子更容易吸附在氣-液界面，并能容易改變構(gòu)型重排形成有序的蛋白質(zhì)分子層，所以起泡性增加[14]。綜合考慮，酶解時間選擇蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性均較好的30min。

圖1 酶解時間對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of hydrolysis duration on foaming ability and foaming stability of albumen protein

2.1.2 木瓜蛋白酶添加量對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，隨著酶添加量的增大，蛋清蛋白的起泡性呈逐漸增大的趨勢，木瓜蛋白酶的添加量為30mg時，蛋清蛋白的起泡性達到最大(P＜0.05)，30mg以后起泡性相差不大(P＞0.05)。酶添加量對蛋清蛋白的泡沫穩(wěn)定性的影響隨著酶添加量的增大而先增大后減小，在1.5mg時達到最大(P＜0.05)，2.5mg以后就基本保持不變(P＞0.05)。因為形成穩(wěn)定泡沫的條件是蛋白質(zhì)分子在氣-液界面凝結(jié)而形成堅固的薄膜，蛋清蛋白質(zhì)分子部分酶解后，各肽鏈展開，有助于它們之間的相互作用而凝結(jié)，使起泡力提高。如果水解程度過高，多肽鏈長度變短，而較短的多肽鏈不利于氣-液界面堅固薄膜的形成，結(jié)果使蛋白質(zhì)溶液的起泡力和泡沫穩(wěn)定性都會隨酶用量的增加而降低[15]。綜合考慮，木瓜蛋白酶的添加量為30mg時蛋清蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性較好。

圖2 木瓜蛋白酶的添加量對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of papain quantity on foaming ability and foaming stability of albumen protein

2.1.3 酶解溫度對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，蛋清蛋白的起泡性隨著溫度的升高呈現(xiàn)下降-上升-下降的趨勢，穩(wěn)定性呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。這可能是由于達到了酶解反應(yīng)的適宜溫度范圍，酶解速度加快，起泡力增大。但當(dāng)溫度超過酶解適宜范圍時，會導(dǎo)致蛋白酶喪失或部分喪失催化活性，溫度過高也會使蛋清蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性使得蛋清粉起泡力降低[16]。綜合考慮蛋清蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，酶解溫度在50℃時較好。

圖3 酶解溫度對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on foaming ability and foaming stability of albumen protein

2.1.4 pH值對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，隨著pH值升高，蛋清蛋白的起泡性先基本保持不變，當(dāng)pH＞9后再呈現(xiàn)下降趨勢；蛋清蛋白泡沫的穩(wěn)定性基本不隨pH值變化而變化。木瓜蛋白酶的最適pH值為5～6.5，但pH值在3～9范圍內(nèi)皆可進行酶解反應(yīng)，從圖4也可以看出在這段范圍附近起泡性和泡沫穩(wěn)定性變化不大，且均較好。

圖4 pH值對蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on foaming ability and foaming stability of albumen protein

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立與顯著性分析

表1 木瓜蛋白酶酶解蛋清蛋白響應(yīng)曲面法試驗因素及水平編碼表Table 1 Factors and their coded levels in response surface analysis

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results for response surface analysis

在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定了酶解時間、酶添加量(100mL 5%蛋清蛋白添加酶的質(zhì)量)、酶解溫度、pH值4個因素的試驗水平，水平編碼見表1，并在此基礎(chǔ)上采用統(tǒng)計軟件Design-Expert 6.0.5進行Box-Behnken試驗設(shè)計，見表2。

對表2試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得起泡性的編碼值的二次多元回歸方程(模型)為：Y＝2.03-0.027X1＋0.029X2-0.024X3-0.0075X4＋0.0071X12-0.045X22-0.083X32-0.045X42＋0.072X1X2＋0.010X1X3-0.030X1X4＋0.060X2X3-0.085X2X4-0.017X3X4。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析(起泡性)Table 3 Variance analysis of the created regression response surface model for foaming ability

對泡沫穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)進行回歸分析后，發(fā)現(xiàn)該模型不顯著，因而不進行方差分析。

從表3可以看出，模型P＝0.0006＜0.01，表明模型極顯著。失擬項P＝0.6276＞0.05，模型失擬項不顯著。模型的調(diào)整系數(shù)R2＝0.8674，調(diào)整絕對系數(shù)R2Adj＝0.7348，說明該模型擬合程度良好，可以用此模型對蛋清蛋白的酶法改性進行分析和預(yù)測。由表3可知，X1、X2、X22、X42、X2X3對蛋清蛋白的起泡性影響顯著(P＜0.05)，X32、X1X2、X2X4影響極顯著(P＜0.01)，X3、X4、X12、X1X3、X1X4、X3X4對其影響不顯著，采用逐步回歸分析的方法，在剔除了不顯著項后得到優(yōu)化回歸方程為：Y＝2.03-0.027X1＋0.029X2-0.024X3-0.0075X4-0.047X22-0.084X32-0.047X42＋0.072X1X2＋0.06X2X3-0.085X2X4。

此時模型P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項P＝0.6632＞0.05，模型失擬項不顯著。說明該方程具有意義，能反映酶解時間、酶添加量、酶解溫度、pH值對蛋清蛋白起泡性的影響。

2.2.2 兩因素顯著交互作用對蛋清蛋白起泡性的影響

圖5 各兩因素交互作用的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of every two factor interactions

2.2.2.1 酶解時間和木瓜蛋白酶添加量的交互作用

由圖5a可知，酶解時間和木瓜蛋白酶添加量的交互作用對蛋清蛋白起泡性具有顯著的影響，酶添加量在20～30mg范圍內(nèi)，隨著酶解時間的延長，蛋清蛋白起泡性逐漸降低，而酶添加量在30～40mg范圍內(nèi)，隨著酶解時間的延長，蛋清蛋白起泡性呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。

2.2.2.2 木瓜蛋白酶添加量和酶解溫度的交互作用

由圖5b可知，木瓜蛋白酶添加量和酶解溫度的交互作用對蛋清蛋白起泡性具有顯著影響，當(dāng)酶解溫度在40～50℃范圍內(nèi)時，酶添加量20～30mg內(nèi)，隨著酶添加量的增大，蛋清蛋白起泡性逐漸增大，而在酶添加量30～40mg內(nèi)，隨著酶添加量的增大，蛋清蛋白起泡性逐漸降低。當(dāng)酶解溫度在50～60℃范圍內(nèi)時，隨著酶添加量的增大，蛋清蛋白起泡性逐漸增大。

2.2.2.3 木瓜蛋白酶添加量和pH值的交互作用

由圖5c可知，木瓜蛋白酶添加量和pH值的交互作用對蛋清蛋白起泡性具有顯著影響，在酶添加量20～30mg范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，蛋清蛋白起泡性逐漸增大，而在酶添加量30～40mg范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，蛋清蛋白起泡性先增大后降低。

2.2.3 最優(yōu)條件的確定及驗證實驗

利用得到的回歸方程，分別對X1、X2、X3、X4求偏階導(dǎo)數(shù)，并令其偏導(dǎo)等于零，通過Design-Expert 6.0.5軟件計算可知，蛋清蛋白起泡性最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為：酶解時間45min、酶添加量38.18mg、酶解溫度47.46℃、pH6.28，起泡性預(yù)測值為2.06。最優(yōu)工藝參數(shù)修正為：酶解時間45min、酶添加量38.2mg、酶解溫度47.5℃、pH6.3，在此條件下進行驗證實驗，所得蛋清蛋白起泡性實際值為2.09，說明建立的數(shù)學(xué)模型可靠性高，可以作為蛋清蛋白起泡性的最佳條件。在溫度47.5℃、pH6.3、處理時間45min情況下進行同種雞蛋蛋清未經(jīng)酶解處理起泡性對比實驗，其結(jié)果為1.21，因此，與此條件下蛋清蛋白起泡性相比，添加木瓜蛋白酶酶解后蛋清蛋白起泡性可提高70%左右。與未經(jīng)任何處理的蛋清蛋白起泡性相比，本實驗所得木瓜蛋白酶最優(yōu)條件下酶解后蛋清蛋白起泡性可提高140%左右。

3 結(jié) 論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇酶解時間、酶添加量、酶解溫度、pH值為自變量，以起泡性能和泡沫穩(wěn)定性為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面法建立各因素與蛋清蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性之間的定量數(shù)學(xué)模型，確定蛋清蛋白起泡性的酶解優(yōu)化工藝參數(shù)為：酶解時間45min、酶添加量38.2mg、酶解溫度47.5℃、pH6.3，在此條件下蛋清蛋白起泡性為2.09，可使蛋清蛋白起泡性得到140%左右的提高。

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Response Surface Methodology for Technological Optimization of Papain Hydrolysis of Albumen Protein for Improved Foaming Properties

TU Yong-gang1，NIE Xu-liang2，XU Ming-sheng1，SUN Chun-mei1，DU Hua-ying1，ZHAO Yan3，DONG Pan3
(1. College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2. College of Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；3. Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The purpose of this study is to optimize the improvement of foaming properties of albumen protein by papain hydrolysis. Foaming capacity and foam stability were investigated with respect to 4 variables including hydrolysis time, papain dosage, temperature and pH. Two quadratic polynomial regression models describing foaming capacity and foam stability were established based on a Box-Behnken experimental design. According to response surface analysis, the foam stability model was not statistically significant, the foaming capacity model displayed a statistical significance, and the optimum enzymatic modification conditions were hydrolysis time of 45 min, enzyme dosage of 38.2 mg/5 mL of egg white, hydrolysis temperature of 47.5℃, and pH 6.3. Under the optimum conditions, the foaming capacity was up to 2.09, indicating an increase of approximately 140% when compared to non-modified albumen protein.

albumen protein；papain；foaming ability；foam stability；response surface methodology

TS253

：A

1002-6630(2011)20-0084-05

2011-06-20

江西省教育廳青年科學(xué)基金項目(GJJ11088)；江西農(nóng)業(yè)大學(xué)自然科學(xué)青年基金項目(9003315)；

江西省科技廳科技支撐計劃項目(20112BBF60016)

涂勇剛(1979—)，男，講師，博士，研究方向為動物性食品科學(xué)與技術(shù)。E-mail：tygzy1212@yahoo.com.cn