pH敏感的殼聚糖接枝聚合物的可控合成及載藥性能研究

錢 駿，姜 晶，曾澤華，陳 陽，潘曉娣，曹金鑫，華道本

（蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部高分子科學(xué)與工程系，江蘇蘇州 215123）

pH敏感的殼聚糖接枝聚合物的可控合成及載藥性能研究

錢 駿，姜 晶，曾澤華，陳 陽，潘曉娣，曹金鑫，華道本

（蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部高分子科學(xué)與工程系，江蘇蘇州 215123）

殼聚糖由于具有良好的生物相容性和可生物降解性，在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。筆者利用鄰苯二甲?；瘹ぞ厶荝AFT聚合法合成了pH敏感的殼聚糖接枝聚丙烯酸2-羥乙酯。殼聚糖氨基可以與羧基等進(jìn)行反應(yīng)，用來包裹含羧基的疏水藥物（如萘普生等）。由于殼聚糖在水溶液中的溶解具有pH依賴性，該接枝聚合物可以作為具有pH響應(yīng)的載藥體進(jìn)行藥物輸送。

殼聚糖 可控改性 藥物輸送 RAFT聚合

殼聚糖是一種生物相容的、可生物降解和無毒害的天然多糖，在生物醫(yī)用等許多領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用［1，2］。但是由于殼聚糖分子間存在氫鍵使其結(jié)晶度高，所以不溶于一般的有機(jī)溶劑，這大大限制了殼聚糖的應(yīng)用。因此許多化學(xué)家都致力于殼聚糖的改性研究，并取得了許多進(jìn)展［3］。近年來，由于在合成結(jié)構(gòu)明確、分子質(zhì)量可控高分子方面的優(yōu)點(diǎn)，可控／活性自由基聚合用于殼聚糖的合成改性也得到了較多的研究。殼聚糖的接枝聚合物不僅具有殼聚糖的特點(diǎn)，而且具有合成聚合物的優(yōu)點(diǎn)，這使得殼聚糖的應(yīng)用范圍可以得到很好地拓寬。El Tahlawy、Lindqvist和Liu等分別利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）方法對(duì)殼聚糖進(jìn)行了接枝改性［4-6］，然而體系中殘存的金屬催化劑限制了其在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用。筆者所在課題組近年來在殼聚糖改性中發(fā)展了可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合方法［7］，并將其應(yīng)用于溫度敏感性殼聚糖接枝聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）的合成［8］。

為了拓展其適用性，筆者利用RAFT聚合法合成了pH響應(yīng)的殼聚糖接枝聚丙烯酸羥乙酯（PHEA），并將其用于帶羧基藥物的可控輸送研究。首先將鄰苯二甲酸酐與殼聚糖上的氨基進(jìn)行反應(yīng)生成鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?，以增加其在有機(jī)溶劑中的溶解度，然后將S-1-十二烷基-S′（α，α′-二甲基-α″-乙酸）三硫代碳酸酯（DDACT）和鄰苯二甲酰化殼聚糖進(jìn)行酯化反應(yīng)生成大分子RAFT試劑，來控制丙烯酸2-羥乙酯的聚合，從而制備鄰苯二甲?；瘹ぞ厶墙又郾┧?-羥乙酯（PHCS-g-PHEA），最后肼解脫保護(hù)氨基，用于帶羧基等藥物的負(fù)載和輸送。合成路線如反應(yīng)式1所示。

1 試 驗(yàn)

1.1 試劑原料

試劑原料如表1所示。

表1 試劑原料

反應(yīng)式1 負(fù)載萘普生藥物的殼聚糖接枝聚丙烯酸2-羥乙酯的合成路線

2.2 殼聚糖的鄰苯二甲?；?/p>

將殼聚糖（脫乙酰度95%，200KDa）和鄰苯二甲酸酐按照摩爾比1∶3（其中殼聚糖的摩爾質(zhì)量為0. 02 mol），投料于100 mL的DMF中，在110℃下反應(yīng)8 h后，用冰水沉淀，離心得到粗產(chǎn)物。將該產(chǎn)物用乙醇抽提24 h。真空干燥，研磨待用。

2.3 殼聚糖大分子RAFT試劑的制備

該實(shí)驗(yàn)所用的RAFT試劑S-1-十二烷基-S′（α，α′-二甲基-α″-乙酸）三硫代碳酸酯（DDACT）是根據(jù)文獻(xiàn)方法［9］制得。將所得的鄰苯二甲?；臍ぞ厶侨苡?00 mL DMF后，加入三硫代碳酸酯（DDACT）和二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），三者的投料摩爾比為1∶1∶1.5（其中DDACT的摩爾質(zhì)量為7.50 mmol）。在室溫下反應(yīng)24 h后，體系由完全溶解狀態(tài)變?yōu)辄S色渾濁溶液，用乙醇沉淀，離心得初產(chǎn)物。該產(chǎn)物用乙醇抽提除去未反應(yīng)的DDACT、脲和殘余的DMF。真空干燥，產(chǎn)率為86%。

2.4 鄰苯二甲?；瘹ぞ厶堑慕又Ω男?/p>

將所得的殼聚糖大分子RAFT試劑（0.72 g）溶于28 mL DMF，加入偶氮二異丁腈（AIBN）（0.02 g）和丙烯酸2-羥乙酯（HEA）（3.60 g），均分于2個(gè)反應(yīng)瓶，通氬氣15 min，在60℃下分別反應(yīng)3.5 h、7.0 h，反應(yīng)結(jié)束后用乙醚沉淀，得到的產(chǎn)物用丙酮抽提。抽提所得的固體為保護(hù)的殼聚糖接枝聚合物（PHCS-g-PHEA），而圓底燒瓶中的抽提液旋干后所得的聚合物即為HEA的均聚物（PHEA）。接枝率可根據(jù)以下公式計(jì)算：

G＝（Wg-W0）／W0

這里Wg和W0分別為接枝聚合物和RAFT試劑的質(zhì)量。

2.5 PHCS-g-PHEA肼解脫保護(hù)

將所得的PHCS-g-PHEA（時(shí)間＝7 h）0.30 g溶于15 mL DMF中，加入水合肼50 μL，在100℃下反應(yīng)2 h后，用乙醚沉淀，再用乙醇抽提24 h，除去肼解下來小分子和PHEA。殼聚糖接枝聚合物（CS-g-PHEA）的質(zhì)量為0.24 g，產(chǎn)率為78%。

2.6 CS-g-PHEA載藥性能的研究

將萘普生0.010 0 g溶于2 mL DMF與2 mL CS-g-PHEA（2.4 mg／mL）的DMF溶液混合12 h。取4. 0 mL的水緩慢滴加于4.0 mL上述溶液中，然后置于透析袋（WMCO＝3 500）中透析，每隔一定時(shí)間，更換透析袋外的液體，漸有白色固體析出。20 h后，倒出透析袋內(nèi)液（18.0 mL），靜置，取上層清液。

取3 mL上述液體置于透析袋（WMCO＝3 500）中釋放，外部液體分別是pH為7.2和5.6的緩沖液100 mL，在設(shè)定的時(shí)間取出10 mL外部液體，同時(shí)添加10 mL緩沖液。將所取出的外部液體測熒光（激發(fā)波長λ exciting＝310 nm，狹縫寬度slit＝4 nm）強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出萘普生藥物的濃度及釋放量。

2.7 表征方法

1H NMR譜圖在INOVA 400MHz核磁共振儀上以DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)測定。紅外光譜（FTIR）采用Mangna-550N icocet紅外光譜儀測定，KBr壓片法。聚合物（PNIPAM，PHEA）的分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布指數(shù)使用waters 1515凝膠色譜儀（GPC）測定，使用RI 2414檢測器，柱子型號(hào)為MZGel SDplus 500A，10E3A，10E4A，以（DMF＋0.05 mol／L LiBr）為流動(dòng)相，流速0.8 mL·min-1，在30℃測定，分子質(zhì)量以聚苯乙烯標(biāo)樣校正。掃描電子顯微鏡SEM采用Hitachi S-570型SEM，測試電壓20 kV。熒光測定是在HORIBA公司生產(chǎn)的Fluoromax-4上完成的。

3 結(jié)果與討論

3.1 殼聚糖RAFT試劑的合成

根據(jù)反應(yīng)式1合成了鄰苯二甲?；瘹ぞ厶荝AFT試劑（PHCS-RAFT），圖1給出了其在DMSO-d6中的核磁譜圖。在δ＝1.20 ppm左右是RAFT試劑DDACT上氫的峰，說明成功制備了大分子RAFT試劑。通過對(duì)核磁特征峰進(jìn)行積分，可以計(jì)算出大約6個(gè)殼聚糖重復(fù)單元接一個(gè)DDACT。元素分析數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)果，見表1所示。

圖1 鄰苯二甲?；瘹ぞ厶荝AFT試劑的核磁共振氫譜（300 MHz，DMSO-d6）

表1 元素分析數(shù)據(jù)

圖2是殼聚糖、鄰苯二甲酰化殼聚糖和殼聚糖大分子RAFT試劑的紅外譜圖。與殼聚糖（圖2（a））相比，鄰苯二甲酰化殼聚糖（圖2（b））在725 cm-1出現(xiàn)了鄰苯二甲酸酐苯環(huán)C—H振動(dòng)峰，并且在1 720 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是殼聚糖上氨基與鄰苯二甲酸酐酰化后形成的酰亞胺鍵的==CO振動(dòng)峰；殼聚糖大分子RAFT試劑（圖2（c））在2 800～3 000 cm-1處峰強(qiáng)明顯增強(qiáng)，是由于RAFT試劑上甲基（—CH3）和亞甲基（—CH2）的作用，而1 520 cm-1處的小峰可能是—S—==CS鍵的振動(dòng)形成的。這些結(jié)果都說明按照前述方法可以成功合成鄰苯二甲酸化殼聚糖RAFT試劑。

圖2 紅外光譜比較

3.2 鄰苯二甲?；瘹ぞ厶墙又酆衔锏暮铣?/p>

根據(jù)RAFT機(jī)理，共聚物鏈上連接的增長鏈自由基與溶液相中分散的增長鏈自由基是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，因此，溶液相中的均聚物可以用來間接表征接枝聚合物的分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布。圖3給出了聚合體系中均聚物的GPC曲線，可以看出圖譜基本呈正態(tài)分布，分子質(zhì)量分布較窄，且隨著聚合時(shí)間的延長分子質(zhì)量增大，這些都說明聚合反應(yīng)基本上按RAFT過程進(jìn)行。

圖3 聚合體系中均聚物聚丙烯酸2-羥乙酯的GPC曲線

利用核磁共振氫譜確認(rèn)了接枝聚合物的結(jié)構(gòu)。圖4是殼聚糖接枝聚合物（PHCS-g-PHEA）的核磁譜圖。在δ＝4.00 ppm處的峰是PHEA支鏈上靠近酯基的亞甲基（—CH2）峰，在δ＝3.60 ppm是PHEA側(cè)鏈上與羥基直接相連的亞甲基（—CH2）峰，在δ＝4.80 ppm附近的是PHEA上羥基（—OH）的峰；δ＝1.60 ppm左右是主鏈上亞甲基（—CH2）和甲基（—CH3）的峰。這些結(jié)果表明成功制備了殼聚糖接枝聚合物。

圖4 鄰苯二甲?；瘹ぞ厶墙又郾┧?-羥乙酯（t＝7 h）的核磁共振氫譜（300 MHz，DMSO-d6）

3.3 萘普生藥物的負(fù)載及釋放

鄰苯二甲?；瘹ぞ厶墙又酆衔锿ǔ？梢杂盟想聛黼陆饷摫Ｗo(hù)［10］，得到氨基脫保護(hù)的殼聚糖接枝聚合物。殼聚糖氨基可以與羧基等進(jìn)行成鹽，用來包裹含羧基的疏水藥物（如萘普生等）（反應(yīng)式1），而且殼聚糖在水溶液中的溶解性具有pH依賴性，所以該接枝聚合物期望能夠作為具有pH響應(yīng)的載藥體進(jìn)行藥物輸送。

圖5 負(fù)載萘普生藥物的殼聚糖接枝聚丙烯酸2-羥乙酯的核磁共振氫譜（300 MHz，DMSO-d6）

圖5是殼聚糖接枝聚合物負(fù)載有萘普生藥物的核磁譜圖。在δ＝7.30 ppm附近的3個(gè)小峰是萘環(huán)上的氫，說明萘普生藥物與CS-g-PHEA絡(luò)合成功。通過熒光分析可知其載藥量（DLC）為5.63%和載藥率（DLE）為1.37%。

將載藥的殼聚糖接枝聚合物置于去離子水中透析，可以形成100 nm左右的納米粒子（圖6）。在不同pH緩沖液中考察萘普生藥物的釋放行為（圖7），可以發(fā)現(xiàn)CS-g-PHEA載藥體系具有pH響應(yīng)性，體系酸性的增加有利于藥物的釋放。

圖6 負(fù)載萘普生藥物的殼聚糖接枝聚丙烯酸2-羥乙酯的SEM圖

圖7 負(fù)載萘普生藥物的殼聚糖接枝聚丙烯酸2-羥乙酯在pH響應(yīng)的釋放曲線

4 結(jié) 論

筆者利用鄰苯二甲酰化殼聚糖RAFT試劑，制備出生物相容的殼聚糖接枝聚合物，由于其是兩親性接枝聚合物，并且殼聚糖的溶解性具有pH響應(yīng)性，所以可以在水中進(jìn)行自組裝，制成具有pH響應(yīng)性的納米粒子。以萘普生為疏水模型藥物，其結(jié)構(gòu)中的羧基與殼聚糖上的氨基相互作用，在接枝聚合物自組裝過程中，萘普生藥物隨著殼聚糖被包裹在納米粒子核內(nèi)。通過SEM可以發(fā)現(xiàn)，CS-g-PHEA在中性水溶液中能較好地進(jìn)行組裝，形成直徑為100 nm左右的納米粒子。釋放實(shí)驗(yàn)表明可以通過改變緩沖液的pH值，可以調(diào)節(jié)萘普生藥物的釋放速率。

致謝：感謝國家自然科學(xué)基金（50903060）、教育部博士點(diǎn)基金（20093201120004）。

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Controlled synthesis of pH-sensitive chitosan graft copolymer for drug delivery

Qian Jun，Jiang Jing，Zeng Zehua，Chen Yang，Pan Xiaodi，Cao Jinxin，Hua Daoben

（Department of Polymer Science and Engineering，College of Materials，Chemistry and Chemical Engineering，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China）

Due to its biodegradability and biocompatibility，there has been many applications of chitosan in biomedical field.Here we report that pH-sensitive chitosan graft copolymers were synthesized via RAFT polymerization of 2-hedroxyethyl acrylate.The amino group of chitosan can be reacted with carboxyl group，which can be used to package the drugs with carboxyl group，such as Naproxen.The graft copolymer may be expected to act as pH-sensitive nanocarrier for drug delivery because of the pH-dependent solubility of chitosan.

chitosan；controlled modification；drug delivery；RAFT polymerization

O636.1

：A

：1006-334X（2011）02-0019-06

2011-06-11

錢駿，男，江蘇蘇州人，研究方向?yàn)樘烊桓叻肿印⒕G色化學(xué)等。