一種精子無(wú)冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍新載體制備

羅樹(shù)偉 林戈 盧光琇

精子庫(kù)現(xiàn)已經(jīng)成為輔助生殖技術(shù)重要組成部分，精子冷凍技術(shù)成熟是建立精子庫(kù)的基礎(chǔ)。精子的傳統(tǒng)冷凍方法40年代以甘油為冷凍保護(hù)劑慢速冷凍法[1]，經(jīng)過(guò)50年代的完善和改良，一直沿用到現(xiàn)在。由于冷凍保護(hù)劑的毒性作用以及在冷凍過(guò)程中冰晶形成，慢速冷凍操作不適合少量精子樣本（嚴(yán)重少精癥精子樣本、睪丸穿刺和附睪穿刺精子樣本）的冷凍。為了有效保存這些少量精子，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用各種不同的載體來(lái)冷凍少量精子，這些載體就包括了透明帶、cryloop環(huán)、銅環(huán)和ICSI注射針等。玻璃化冷凍最早是有Luyet在1937年提出，玻璃化冷凍可以完全避免冰晶行成對(duì)細(xì)胞的損傷，同時(shí)可以保持細(xì)胞內(nèi)分子相對(duì)空間位置，自從1998年應(yīng)用到人類胚胎冷凍上以來(lái)[2]，人類胚胎玻璃化冷凍越來(lái)越成為保存人類胚胎的主要的方式。精子與卵裂期胚胎不同，精子不能耐受滲透損傷，并且對(duì)冷凍保護(hù)劑毒性敏感，常規(guī)玻璃化冷凍方法不能保存少量精子，為此國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用無(wú)冷凍保護(hù)劑的方式玻璃化冷凍保存人類精子，并獲得初步成功[3-5]。為了減少精子質(zhì)量對(duì)結(jié)果的影響，本研究采用正常精液來(lái)研究分析一種新型精子冷凍載體冷凍效果。

1 材料與方法

1.1 精液樣本的收集和處理 收集非男方因素IVF夫婦中男方精液，其中精液精子密度＞50×106/ml，a級(jí)+b級(jí)精子＞50％的精液標(biāo)本列入研究對(duì)象，收集精液樣本10份，精子質(zhì)量評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)參考世界衛(wèi)生組織《人類精液及精子宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)》第四版[6]。將收集的精液37℃液化30～40分鐘，完全液化后，采用Isolate試劑行密度梯度離心分離活動(dòng)精子，300g離心20分鐘，去上清，加入1ml精子洗滌液（GMOPS+5％HSA）混勻，200g離心5分鐘，去上清，在精子沉淀上加入1ml洗滌液，使沉淀和上層洗滌液形成清晰的分界線，45°傾斜離心管，37℃孵育20分鐘，然后取上清液體備用，并采用Makler板計(jì)數(shù)精子數(shù)目和活動(dòng)精子數(shù)目。

1.2 精子伊紅染色 按照世界衛(wèi)生組織《人類精液及精子宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)》第四版[6]配制精子伊紅染色試劑，用生理鹽水配制5g/L的伊紅Y染液，充分溶解，然后過(guò)濾備用。將一滴洗滌后或解凍后洗滌后精子懸液與一滴伊紅溶液在顯微鏡載玻片上充分混勻，并覆蓋玻片，30秒后在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，活精子不著色，死精子被染成紅色。

1.3 新型冷凍載體和開(kāi)放式冷凍載體的制備 新型冷凍載體的制備：將普通胚胎冷凍麥管下端3cm區(qū)域采用細(xì)砂紙將外側(cè)面打磨粗糙。將麥管打磨區(qū)域沿麥管軸線剪一1/8圓周的細(xì)縫，選擇大小合適的輸液針套將麥管打磨區(qū)域套住。開(kāi)放式冷凍載體的制備：按照Isachenko報(bào)道的方法制備[7]，取普通胚胎冷凍麥管，將其下端1cm區(qū)域沿軸線剪掉一半，使麥管下端1cm形成半圓形槽狀。分別在載體麥管上標(biāo)記好標(biāo)本號(hào)和管號(hào)。

1.4 新型冷凍載體精子懸液量承載量確定 將輸液針套套在打磨好的麥管下端，采用加樣槍分別加入10ul、9ul、8ul、7ul、6ul、5ul、4ul、3ul、2ul、1ul精子懸液，倒置麥管及輸液針套管，緩慢拉動(dòng)輸液針套管，最終使輸液針套管脫離麥管，然后采用1ul加樣槍測(cè)量輸液針套管上存留的液體量，根據(jù)麥管打磨段液體存留情況和套管上存留液體量來(lái)判定新型載體液體承載量。

1.5 精子無(wú)冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍和解凍 新型載體精子冷凍，首先將輸液針套套緊在麥管打磨區(qū)域，采用加樣槍吸取5ul處理后的精子懸液加在輸液針套頭端，倒轉(zhuǎn)麥管，使套管位于上方，緩慢上體套管，使精子懸液均勻涂布在打磨好的麥管上，然后倒轉(zhuǎn)麥管，使麥管表面液體形成較均勻的液體薄層，迅速將麥管浸入液氮中，將麥管置外套管內(nèi)。新型載體精子解凍，將精子洗滌液10ml加入到15ml錐形離心管中，37℃預(yù)熱30分鐘，從液氮中迅速取出冷凍麥管并置預(yù)熱好10ml洗滌液中，同時(shí)不停攪動(dòng)，使迅速解凍，連續(xù)解凍5管，300g離心5分鐘，去上清，加洗滌液0.1ml，37℃孵育20分鐘，鏡下計(jì)數(shù)活動(dòng)精子的數(shù)目，同時(shí)行精子伊紅染色，計(jì)數(shù)活精子和死精子數(shù)目。開(kāi)放式載體精子冷凍，將洗滌好的精子懸液1ul，加入開(kāi)放式載體下端的凹槽中，距離下端約0.5cm。迅速精開(kāi)放式麥管侵入液氮中，將麥管置外套管內(nèi)。開(kāi)放式麥管載體精子解凍方法同新型載體精子解凍方法。

2 結(jié)果

2.1 新型精子冷凍載體可有效承載5ul精子懸液形成液體薄膜通過(guò)在輸液針套上加入不同量的精子懸液、麥管打磨段液體存留情況及套管上存留液體量，當(dāng)加入精子懸液量≥7ul時(shí)，液體量存留量＞1ul，顛倒麥管可以看到明顯液體流動(dòng)，加入6ul精子懸液時(shí)，存留液體量約1ul，當(dāng)加入5ul精子懸液時(shí)，存留液體量＜1ul，加入液體量＜4ul時(shí)，套管上未有液體，麥管下端存在部分區(qū)域未涂抹液體。在顯微鏡下觀察2種載體上的精子，在新型載體上形成一薄層液體，液體中可見(jiàn)精子的存在，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)新型載體也存在部分區(qū)域無(wú)薄層液體覆蓋。

2.2 新型精子冷凍載體具有良好的玻璃化冷凍效果 新型精子冷凍載體和開(kāi)放式精子冷凍載體上精子冷凍后，以處理后未冷凍前精子懸液為對(duì)照[活動(dòng)率（93±4）％，存活率（96±3）％]，新型載體和開(kāi)放式載體解凍后精子活動(dòng)率和存活率均下降，活動(dòng)率分別為（70±2）％和（65±3）％，存活率分別為（74±4）％和（66±3）％（P＜0.05），新型載體明顯優(yōu)于開(kāi)放式載體。

3 討論

目前胚胎玻璃化冷凍技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到人類輔助生殖技術(shù)，玻璃化冷凍也慢慢應(yīng)用到人類胚子中，如人類卵母細(xì)胞的冷凍，玻璃化冷凍技術(shù)是在人類輔助生殖技術(shù)中起著重要的作用，具有逐漸取代人類胚胎慢速程序冷凍的趨勢(shì)。玻璃化冷凍過(guò)程中需要加入高濃度的冷凍保護(hù)劑（30％～50％），慢速冷凍則需要5％～7％冷凍保護(hù)劑的濃度，高滲透壓不利于精子冷凍，然而，精子具有實(shí)現(xiàn)無(wú)冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍的條件，精子含有大量的蛋白質(zhì)、糖和其他成分，在精子內(nèi)估計(jì)可達(dá)45％～77％，而在卵裂球和卵母細(xì)胞中只占有20％～25％[4]。玻璃化冷凍和解凍的速度與冷凍保護(hù)劑的濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，也就是說(shuō)，高濃度的冷凍保護(hù)劑，需要相對(duì)較低的冷凍速度就可以實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍，冷凍的速度越快，實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍所需要冷凍保護(hù)劑的濃度越低[8]，當(dāng)精子冷凍速度達(dá)到一定限度時(shí)，在精子內(nèi)部并沒(méi)有見(jiàn)到冰晶的形成[9]。影響玻璃化冷凍的因素：液體的體積、溶質(zhì)濃度、液體導(dǎo)熱性能、液體玻璃化溫度[10]，容易調(diào)整的因素為液體的體積，提高冷凍和解凍速度的方法降低液體體積和增大表面積/體積比，采用不同的載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，冷凍載體選擇很重要，所以提高精子無(wú)冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍的重點(diǎn)就放在載體的設(shè)計(jì)上，目前比較常用的冷凍載體為loop環(huán)，loop環(huán)的液體承載量約20ul，所形成的液體薄層平均厚度為0.07cm，由于雙面接觸液氮，實(shí)際有效厚度為0.035cm，開(kāi)放式載體精子懸液的液體承載量為1ul，假設(shè)其形成半球形，液體的厚度為球體半徑，為0.08cm，而本實(shí)驗(yàn)所采用的新型冷凍載體的液體存在量約為5ul，麥管的直徑為1mm，如果液體精子懸液均勻涂布在麥管外表面，精子懸液可形成0.008cm，所形成液體厚度遠(yuǎn)薄于開(kāi)放式載體。新型載體與開(kāi)放式載體相比較，所承載的精子液體量較多，但相對(duì)loop環(huán)載體承載量要小，新型載體存在的不足有：1）精子懸液不能均勻涂布在麥管外表面，可以考慮對(duì)麥管的內(nèi)表面進(jìn)行打磨，打磨的凹槽為螺旋形，由于表面張力的作用，精子懸液應(yīng)該可以均勻涂布在麥管內(nèi)表面，同時(shí)對(duì)麥管材料進(jìn)行改良，用親水性材料制作麥管，以改善精子懸液的涂布，形成均一液體薄層；2）液體承載量相對(duì)較小，可以考慮適當(dāng)加深凹槽的深度和凹槽長(zhǎng)度，同時(shí)提高精子密度以減少精子懸液量。由于目前實(shí)驗(yàn)條件所限制，不能在麥管內(nèi)表面打磨細(xì)小凹槽，無(wú)法對(duì)新型載體進(jìn)行進(jìn)一步改良?？偟膩?lái)說(shuō)，本實(shí)驗(yàn)所采用的新型載體能有效承載精子進(jìn)行精子無(wú)冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍，可作為精子無(wú)冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍的載體，并且具有改良優(yōu)化的空間。

[1]Polge C,Smith,AU,et al.Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures[J].Nature,1949,164（4172）：666-676.

[2]Vajta G,Holm P.Open Pulled Straw（OPS）vitrification：a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos[J].Mol Reprod Dev,1998 51（1）：53-58.

[3]Nawroth F,Isachenko V.Vitrification of human spermatozoa without cryoprotectants[J].Cryo Letters,2002,23（2）：93-102.

[4]AbdelHafez F,Bedaiwy M.Techniques for cryopreservation of individual or small numbers of human spermatozoa：a systematic review[J].Hum Reprod Update,2009,15（2）：153-164.

[5]蔣凌英,靳雷,朱桂金,等.精子冷凍環(huán)無(wú)保護(hù)劑玻璃化冷凍方法的初步研究[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2006,15（4）：234-236.

[6]世界衛(wèi)生組織.WHO人類精液及精子-宮腔黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2001：51.

[7]Isachenko V,Isachenko E.Clean technique for cryoprotectant-free vitrification of human spermatozoa[J].Reprod Biomed Online,2005,10（3）：350-354.

[8]Fahy GM,MacFarlane DR.Vitrification as an approach to cryopreservation[J].Cryobiology 1984,21（4）：407-426.

[9]Morris GJ.Rapidly cooled human sperm：no evidence of intracellular ice formation[J].Hum Reprod.2006,21（8）：2075-2083.

[10]sachenko E,Isachenko V.Vitrification of mammalian spermatozoa in the absence of cryoprotectants：from past practical difficulties to present success[J].Reprod Biomed Online,2003,6（2）：191-200.