干細胞在壓力性尿失禁中的應(yīng)用

徐 磊，石 紅

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116011)

目前，全世界有20億人正遭受著壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)的病痛。挪威的EPINCOT研究顯示，年齡在20～34歲之間的女性尿失禁的患病率為15%，75歲以上的女性患病率升高到35%，患病率與年齡呈正相關(guān)。瑞士的一項對1081位女性進行的縱向人口調(diào)查發(fā)現(xiàn)，尿失禁的患病率從1991年的15%上升到2007年的28%[1]。

之前的治療方案在不同程度上都存在一定的缺陷。應(yīng)用α、β腎上腺素能阻滯劑治療SUI還沒有通過美國的FDA和歐洲的EMEA批準[2]，而度洛西汀也未得到FDA的批準，在患者不想進行手術(shù)而主動要求藥物療法時，才可作為二線的藥物給予治療。單純的盆底肌訓(xùn)練，或者配合生物反饋和電刺激的治療是SUI的一線療法，治療至少需要3個月的時間，但是效果并不理想。經(jīng)膀胱鏡進行填充劑的注射在SUI治療后可獲得短期的成功[3]，但是伴隨而來的是嚴重的慢性炎癥，巨細胞反應(yīng)，尿道周圍膿腫，以及下尿路阻塞引起的尿儲留，排尿功能障礙，內(nèi)臟移位甚至肺栓塞。自體脂肪注射會因為轉(zhuǎn)移到其它部位而發(fā)生嚴重的不良反應(yīng)[4]。傳統(tǒng)上用于治療SUI的尿道懸吊術(shù)、恥骨陰道懸吊術(shù)(PVS)等，已經(jīng)基本被經(jīng)陰道無張力尿道中段懸吊帶術(shù)(TVT)所取代。TVT為目前SUI治療的金標準，治療后11年成功率可達到77%。對于括約肌功能不足引起的尿失禁，TVT可以達到一個很好的治療結(jié)果，成功率為87%。但是，TVT與PVS、尿道中段懸吊術(shù)(TOT)在膀胱病變、尿路阻塞、排尿障礙、復(fù)發(fā)性感染和網(wǎng)格侵蝕等方面都無明顯差別[5]。

干細胞療法是目前最新治療SUI的方法。研究者嘗試應(yīng)用細胞療法使SUI患者功能障礙的肌肉和結(jié)締組織再生，最常見用于治療的兩種干細胞為胚胎干細胞和成體干細胞[6]。

1 SUI的分型

SUI可以分為兩類：一類是解剖型SUI，是由于盆底肌肉筋膜松弛，使得膀胱頸和尿道活動度增加所引起的；另一類為內(nèi)括約肌功能障礙型SUI，主要是由于膀胱頸和尿道括約肌關(guān)閉功能不全引起的。干細胞主要適用于第2類SUI的治療，通過移植后干細胞的增殖和分化，來恢復(fù)括約肌的功能。過去，用于治療的方法主要為藥物治療、手術(shù)治療和加強盆底肌肉的治療。藥物治療的效果不理想；加強盆底肌肉的治療過程漫長，且治愈率低；各種懸吊術(shù)在治療解剖型SUI時效果顯著，但對于括約肌功能障礙型SUI卻無顯著效果；大劑量注入填充質(zhì)雖然能在短期內(nèi)恢復(fù)尿道功能，但是術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，并且容易引起嚴重的并發(fā)癥[7]。移植自體干細胞治療的出現(xiàn)則解決了以上治療的困難。

2 干細胞治療的輔助檢查

老年人尿失禁發(fā)病率較高，被認為是尿道括約肌再生性低下所引起的。Strasser等[8]通過檢測尿道和括約肌細胞的密度、凋亡特征來測定括約肌老化過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變。結(jié)果顯示年齡的增長與橫紋肌細胞數(shù)量下降呈正相關(guān)，新生兒尿道前括約肌的橫紋肌細胞數(shù)量約占總細胞數(shù)的87.6%，而92歲女性只占總數(shù)的34.2%。近年來研究者對SUI的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)進行了很多研究，通過影像學(xué)和尿動力學(xué)實驗測定尿道括約肌、膜性尿道的主要肌肉并不困難。應(yīng)用傳統(tǒng)的三維尿道超聲進行檢查，發(fā)現(xiàn)橫紋括約肌為尿道閉合機制的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[9]，橫紋肌的收縮性與尿失禁的等級、臨床特征顯著相關(guān)。

除了病人的臨床病史和尿動力學(xué)檢查外，不同超聲技術(shù)由于可以清楚呈現(xiàn)尿道括約肌的形態(tài)，因此也成為診斷尿失禁的有效方法。正常女性橫紋肌厚度為3.5 mm，收縮時為1.8 mm。I級SUI女性括約肌厚度為3.2 mm收縮后為1.6 mm[10]。正常男性、尿失禁男性以及I級SUI男性的收縮評估結(jié)果分別為1.42 mm和0.59 mm和0.82 mm[11]。這些結(jié)果說明，尿道括約肌的形態(tài)特征和收縮性的評估可以為SUI診斷和治療提供依據(jù)。

Digesu G等[12]通過三維超聲檢測完全治愈以及治療后復(fù)發(fā)的患者，結(jié)果顯示前者的括約肌數(shù)量明顯多于后者。對原發(fā)性和繼發(fā)性SUI的女性進行超聲檢查未發(fā)現(xiàn)明顯差別。相對于傳統(tǒng)的測定尿道功能的手段，三維超聲無疑為更加有效的輔助診斷手段。

另一方面，磁共振成像越來越多的應(yīng)用于括約肌功能障礙而引起SUI的患者。一些影像學(xué)特征的變化在括約肌功能障礙的患者中很常見，如尿道短，尿道肌肉薄，或者膀胱頸異常。正常人尿道的平均長度為3 cm，當尿道長度<3 cm，且尿道括約肌功能減弱時更易引起SUI。

3 治療SUI干細胞的種類

干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞的治療雖然在理論上成立，但是由于倫理道德的問題，以及細胞調(diào)控困難而不能應(yīng)用于治療。成體干細胞則沒有倫理方面的顧慮。成體干細胞常常被認為是骨髓基質(zhì)干細胞，骨髓腔中包含數(shù)種細胞群，其中的間葉細胞(mesenchymal cell MSCs)，可以向多個方向轉(zhuǎn)化，然而，獲得自體骨髓干細胞具有明顯的局限性，需要在全麻下進行，帶來巨大的疼痛感，并且每次只能獲取極少量的干細胞，這些都降低了應(yīng)用骨髓干細胞治療SUI的可行性[13]。成體干細胞分為很多種類，經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)，肌源性干細胞和脂源性干細胞被認為是很適合應(yīng)用于治療SUI的原料，因為它們可以在局麻下大量獲得，不會對機體造成嚴重的損傷。肌源性細胞治療由于移植后的低存活率而阻礙了其發(fā)展。為了提高生存率，需要挑選出特別的干細胞，即MDSCs(Muscle-derived stem cells)，這種干細胞具備多種優(yōu)點。首先，MDSCs不同于其他平滑肌細胞，它能分化組成肌管，由于在此過程中要經(jīng)歷有絲分裂，因此降低了其無限繁殖的可能性以及阻塞尿道的風險。其次，MDSCs分化的肌管和肌纖維能夠整合到宿主的肌肉中，以此避免發(fā)生免疫和過敏反應(yīng)。最后，MDSCs已經(jīng)被證明比其他肌源性細胞具有更好的存活和繁殖能力[14]，因為它表達很低的MHC-1，不會引發(fā)活性淋巴細胞的滲透，降低了免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率。這些優(yōu)點使MDSCs成為治療SUI的最具潛能的材料。而另外一種具備潛能的材料為成肌細胞和成纖維細胞，將它們聯(lián)合應(yīng)用治療SUI，也能取得很好的臨床效果。但面臨的問題是大劑量的成纖維細胞能夠引起尿道組織柔韌性的降低，并且產(chǎn)生尿路梗阻，所以準確把握移植的量以及部位對于治療效果至關(guān)重要[15]。

4 干細胞移植技術(shù)的發(fā)展

干細胞移植用于治療SUI在早期被多種因素所阻礙，如移植后的低存活率，細胞移植部位的不準確和控制移植細胞數(shù)量的困難等。隨著實驗研究的不斷發(fā)展，以上諸多問題都被解決了。首先，利用preplating技術(shù)，可以分離出特殊的干細胞，因為這種干細胞在體外表現(xiàn)出很慢的分裂時間和極小的融合能力，需要經(jīng)過5～6 d才能粘附到燒瓶上。這種干細胞即MDSCs，其具有很強的存活能力，因此解決了干細胞移植后低存活率的問題[16]。此后出現(xiàn)的經(jīng)尿道超聲引導(dǎo)技術(shù)取代了早期的經(jīng)尿道內(nèi)窺鏡技術(shù)，這種技術(shù)能夠確保干細胞注射到指定的部位。為了準確的調(diào)整注射劑量，一種特別設(shè)計的注射器因運而生，用于精確的注射干細胞。這些技術(shù)都在很大程度上推動了干細胞治療SUI的進程。

5 干細胞治療SUI的實驗室研究

Furuta A等[15]首先報道了應(yīng)用干細胞治療SUI的實驗。他們將通過活檢獲得的肌肉組織分離后得到成肌細胞，然后經(jīng)尿道將成肌細胞注射到SUI小鼠模型的括約肌中，結(jié)果證明移植后的成肌細胞能夠使括約肌再生，恢復(fù)括約肌的功能，因此邁出了干細胞治療SUI的第一步。

Lee等[16]利用preplating技術(shù)分離提純肌源細胞群，得到MDSCs，解決了干細胞移植后的低存活率問題。實驗中，將MDSCs注射到SUI小鼠模型的尿道括約肌中。最終結(jié)果顯示，經(jīng)過MDSCs注射的小鼠漏尿點壓(leak point pressure LPP)值基本恢復(fù)正常，此外，括約肌細胞數(shù)量和纖維數(shù)量也都明顯增加，并且沒有檢測到CD8的存在。由此證明了干細胞治療SUI的安全性。

Strasser等[18]通過對豬進行實驗，進一步驗證了干細胞治療SUI的可行性。首先，對8頭豬進行肌肉活檢得到骨骼肌組織，通過酶催化分離提純出單克隆的成纖維細胞和成肌細胞，將它們進行免疫熒光標記后注射到尿道括約肌中。組織學(xué)檢查顯示移植的細胞至少能存活10周，熒光成像顯示成肌細胞在尿道組成了新的成纖維細胞。此外，尿道閉合壓也明顯增加。這一實驗很大程度的推進了應(yīng)用成體干細胞治療SUI的進程。

Chermansky等[19]通過小鼠模型證實干細胞治療SUI的可行性。將MDSCs注射到小鼠模型的尿道后發(fā)現(xiàn)，MDSCs能夠融合到被腐蝕的中段尿道的平滑肌層。此外，與那些只注射鹽水的被腐蝕的尿道相比，注射了MDSCs的尿道平滑肌層鄰近部位的神經(jīng)組織也在不斷的增加。這些結(jié)果顯示MDSCs在尿道組織中有多向分化的能力，并且可以引起自分泌作用，使肌肉神經(jīng)恢復(fù)的更加完全。此外，注射MDSCs組的LPP值相對于只注射鹽水組顯著提高，在注射后的第4周基本恢復(fù)到正常水平。

Kwon等[20]通過SUI小鼠模型的實驗來比較MDSCs與成纖維細胞。用LPP來對比二者的功能，短期實驗顯示當每組劑量相同時，MDSCs，成纖維細胞以及二者的混合物所產(chǎn)生的治療效果無明顯差別，但當將劑量提高到10倍時，只有大劑量的成纖維細胞能導(dǎo)致尿道阻塞，同樣高劑量的MDSCs則沒有引起這樣的不良反應(yīng)。提示成纖維細胞可能引起嚴重的不良反應(yīng)，盡管能夠改善SUI癥狀，使LPP值增加，但是卻很大程度地降低了尿道的柔韌性。已經(jīng)通過實驗證明了成纖維細胞治療SUI存在一定風險，應(yīng)當準確把握注射的劑量和部位，才能有效的降低尿道阻塞等不良反應(yīng)的發(fā)生。

6 干細胞治療SUI的臨床研究

首個臨床實驗是在歐洲完成的。主要問題是在成肌細胞，成纖維細胞和膠原質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用中，評估成肌細胞在聯(lián)合治療中的作用很困難。Strasser等[11]在2002～2004年之間通過對比實驗，驗證了成體干細胞治療與膠原質(zhì)治療的區(qū)別。對其中的63位患者進行干細胞注射治療，對另外29位患者進行膠原質(zhì)注射治療，然后將二者的治療結(jié)果進行比較。干細胞注射治療的過程是在經(jīng)尿道超聲引導(dǎo)下進行的。值得注意的是，該技術(shù)的應(yīng)用有著重要的作用，能夠準確地將干細胞注射到指定的部位。然后用尿道探針將成纖維細胞注射到黏膜下，用于治療黏膜萎縮，再將成肌細胞注射到橫紋括約肌中，進行肌肉重塑(成肌細胞和成纖維細胞都是從病人上臂活檢中獲得)。膠原質(zhì)注射治療的過程是在尿道內(nèi)窺鏡下進行的，膠原質(zhì)作為填充劑注射到尿道用來強化尿道壁。1年后的實驗結(jié)果顯示，盡管注射膠原質(zhì)組的生活質(zhì)量(Incontinence Quality of Life I-QOL)和尿失禁指數(shù)都明顯改善，但是只有2例患者(10%)的尿失禁治愈，其他病人無相關(guān)的改變。相反，經(jīng)過干細胞治療組中，50例患者的尿失禁被治愈，12例患者的癥狀明顯改善，只有1例治療效果不顯著，他們的平均尿失禁指數(shù)也由術(shù)前的5.95降低到術(shù)后的0.44，此外，干細胞注射治療后沒有發(fā)生嚴重的并發(fā)癥。但是此次實驗還存在一些不足：注射過程中無法準確控制注射的劑量；前列腺切除術(shù)后的男性病人，進行細胞注射治療的困難性也影響了治療后的結(jié)果；此外，臨床實驗時間的短暫以及病人數(shù)量的不足都對實驗的準確性造成了一定的影響。

為了評定自體成纖維細胞和成肌細胞移植治療的效果和安全性，Mitterberger等[21]對123名SUI的女性患者進行干細胞治療，應(yīng)用經(jīng)尿道超聲技術(shù)，將自體成肌細胞注射到橫紋括約肌中，將自體成纖維細胞注射到黏膜下層，然后進行觀察。1年后得到的結(jié)果為79%的患者完全可以控制排尿，21%的患者有顯著或者輕微的改善。她們的尿失禁指數(shù)、I-QOL指數(shù)以及橫紋括約肌的收縮性都顯著改善。此外，移植后的患者都沒有發(fā)生明顯的不良反應(yīng)和并發(fā)癥，這些結(jié)果都證明了自體干細胞移植治療的效果和安全性。

干細胞治療SUI的研究已經(jīng)拓展到前列腺切除術(shù)后尿失禁(post-prostatectomy incontinence PPI)的領(lǐng)域。之前，治療PPI的金標準為移植人工尿道括約肌。這項技術(shù)雖然治愈率高，但是移植后需要再次修補。Mitterberger等[21,22]在2004～2005年之間，對63位PPI患者進行成肌細胞和成纖維細胞注射治療，將成纖維細胞注射到尿道黏膜下層，然后將成肌細胞移植到橫紋括約肌中。1年后的結(jié)果顯示，65%的患者可以控制排尿，27%的患者癥狀明顯改善，8%的患者沒有改變。這些臨床治療的結(jié)果證明了運用成肌細胞和成纖維細胞的治療方法，可以增加肌肉細胞的數(shù)量，恢復(fù)括約肌的收縮性，并且增加黏膜的厚度，達到徹底治愈PPI的目的。但是，此次實驗沒有設(shè)立對照組，而且所有的患者都是由1位醫(yī)生進行治療，因此存在一定的誤差。

Carr LK等[23]報道了移植MDSCs的臨床結(jié)果。臨床試驗所應(yīng)用的試劑是從大腿側(cè)壁活檢中得到的。將MDSCs經(jīng)尿道和尿道周圍途徑，首先應(yīng)用8 mm的Cook Williams膀胱鏡注射針將MDSCs注射到尿道的3、9點的位置，然后應(yīng)用10 mm的Williams注射針，將MDSCs注射到尿道的3、6、9、12點位置，最后將MDSCs注射到患者的尿道周圍。經(jīng)過1年的跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)8例患者中有5例癥狀明顯改善。另外，對兩名患者進行膀胱鏡檢查，沒有發(fā)現(xiàn)中尿道組織明顯變化。這些結(jié)果說明應(yīng)用MDSCs治療SUI的可行性及細胞放置的位置對于治療效果的重要性。

7 小 結(jié)

干細胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。這一特點使得干細胞能夠用于恢復(fù)尿道功能，從根本上治療SUI。用于移植的干細胞一般是取自患者自身，通過preplating技術(shù)分離培養(yǎng)后，再移植到患者的尿道，因此避免了發(fā)生嚴重的免疫反應(yīng)，通過移植后的免疫組化可以證明這一點。細胞的移植不僅僅起到填充劑的作用，當移植到尿道后，可以長期的繁殖、自我更新和多向分化，從而補充了橫紋括約肌的細胞數(shù)量，恢復(fù)了萎縮尿道黏膜的功能[24]。移植的干細胞可以釋放神經(jīng)生長因子(nerve growth factor NGF)，提高軸索的再生以及神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)。這一點支持了干細胞具有自我更新和多項分化的能力。釋放的NGF等生長因子，通過自分泌和旁分泌作用促進更加完整的反應(yīng)，引起肌肉和神經(jīng)的再生性修復(fù)，最終達到從根本上治愈SUI的目的[25]。干細胞移植能夠提高治療率和降低治療風險。然而不是所有的干細胞療法治療效果都相同，正如MDSCs，成肌細胞和成纖維細胞所表現(xiàn)出的不同效果和安全性，因此，還需要不斷的探索和研究，來確定最適合的治療方案。此外，大量的隨機對照實驗以及長期的觀察研究也是至關(guān)重要的。隨著研究不斷推進，干細胞在SUI的治療領(lǐng)域?qū)碛袕V闊的前景。

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