受體型酪氨酸激酶RON在乳腺癌侵襲及轉移中的作用研究進展

莫光泉，張宏穎 綜述,李連宏 審校

(大連醫(yī)科大學 病理學與法醫(yī)學教研室, 遼寧 大連 116044)

乳腺癌(breast cancer)發(fā)生率為28%，位于女性腫瘤的首位；死亡率為15%，僅次于肺癌，位列第二，為最常見于女性的致命性腫瘤之一，易復發(fā)和轉移[1]。因而，闡明乳腺癌轉移的細胞和分子機制有望為乳腺癌治療提供更好的方法。RON(The recepteur d'origine nantais)蛋白是受體型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases，RTK)大家族中c-Met子家族的一員，其生物學效應主要是通過與它的配體——巨噬細胞刺激蛋白(macrophage stimulating protein，MSP)結合而活化，通過許多細胞內信號級聯(lián)反應，導致細胞增殖、移動和基質侵襲。RON在包括乳腺癌在內的許多人類腫瘤中過表達，并且有臨床研究表明RON過表達與腫瘤病人預后不良和轉移都有關系。在轉基因小鼠上誘導RON過表達會導致肺和乳腺的腫瘤形成，并與腫瘤轉移播散有關[2]。這些都提示RON與人體乳腺癌形成和播散有關。本文重點綜述RON在乳腺癌侵襲及轉移中作用的研究進展。

1 原癌基因RON蛋白的生物學特征

編碼RON蛋白的cDNA最初是在1993年從人的皮膚角化細胞中克隆而來。RON基因由20個外顯子和19個內含子組成，定位于人類染色體3p21。成熟的RON蛋白是由α/β兩個蛋白亞單位組成的單體，相對分子質量約為185 kD。α-亞單位的相對分子質量約40 kD，完全位于細胞膜外。β-亞單位的相對分子質量約為145 kD，由胞外區(qū)、跨膜片段和胞內激酶區(qū)三部分組成，與α-亞單位間通過二硫鍵相連。胞外區(qū)含有各種活性結構，如N-末端信號(semaphoring，SEMA)功能域、1個叢蛋白-信號-整合素(plexin-semaphor-integrin，PSI)構型區(qū)和4個免疫球蛋白-叢蛋白-轉錄(immunoglobulin-plexin-transcription，IPT)結構域。胞內區(qū)含有多個重要的酪氨酸殘基，后者的磷酸化反應是RON生物學功能的基礎。C-末端有多個信息分子錨定位點，是RON與下游信息分子接觸、傳遞信息的重要結構點。MSP為目前唯一所知的RON的特異性配體，又稱為肝細胞生長因子樣蛋白(hepatocyte growth factor-like protein，HGFL)。HGFL的無活力前體主要由肝細胞合成和分泌[3]，在病理狀況下，HGFL經(jīng)酶水解作用后，在細胞表面形成成熟的雙鏈蛋白，其β鏈以“酶-底物”模式結合于RON并誘導其生物學活性。

RON主要表達于人體各種上皮細胞，如結腸和乳腺上皮細胞。許多不同類型的終末分化巨噬細胞亦有RON表達[4]，在肺泡、甲狀腺、心臟、平滑肌、成纖維細胞和內皮細胞幾乎沒有RON的表達[5]。在進化上，RON對正常的胚胎發(fā)生是必需的。完全敲除RON基因會引起小鼠胚胎在早期階段死亡。有研究表明Sp-1位點是RON啟動子保持活性所必須的，Sp-1依賴的RON酪氨酸激酶表達和乳腺癌細胞侵襲之間有明顯聯(lián)系[6]。

RON的激活方式有兩種，即MSP依賴性和MSP非依賴性途徑。RON的SEMA域與MSP的β鏈結合而引起RON受體分子同源二聚化，從而誘導其磷酸化和激酶的激活。RON也能在沒有配體MSP存在下傳導信號，細胞粘附于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，如Ⅳ型膠原，通過整合素的介導，RON通過發(fā)生自身磷酸化而激活。但是，RON介導的細胞增殖和移動都需要MSP的參與。單獨MSP或RON mRNA過表達不會和患者疾病狀況有顯著聯(lián)系，表明RON在乳腺癌轉移中的功能很可能是配體依賴性的[7]。MSP的激活能增強巨噬細胞的趨化性，MSP刺激RON導致細胞形狀和活動力改變[8]。通過RON進行的MSP依賴性和MSP非依賴性信號傳導在某種程度上可以通過Src家族的激酶介導。以上表明，RON有兩種可選的信號傳導模式來促進正常乳腺上皮細胞癌變[9]。RON激活后向胞內轉導級聯(lián)信號，促進細胞生存、增強細胞播散和移動。RON受體激活導致受體酪氨酸激酶下游區(qū)信號傳導通路激活，而在腫瘤模型中最突出的信號途徑是Ras/有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/Akt和β-連環(huán)蛋白的激活。其他信號途徑還包括jun N-末端激酶(JNK)/應激激活蛋白激酶、局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、c-Src、Smad和核因子-κB(NF-κB)分子等[10]。

2 RON在乳腺癌侵襲及轉移中的作用

腫瘤侵襲與轉移過程至少涉及到以下幾方面的調控因素：1)粘附分子參與腫瘤細胞間的分離以及腫瘤細胞與胞外基質的粘附；2)腫瘤細胞或間質細胞分泌的蛋白水解酶及其抑制劑在降解胞外基質和血管的基底膜過程中發(fā)揮重要作用；3)在基底膜缺損區(qū)域腫瘤細胞以自身的阿米巴運動方式發(fā)生移動和侵襲，在血管或淋巴管內啟動血小板聚集，形成腫瘤細胞栓子，遷移到淋巴結或轉移靶器官；4)新生血管形成，伴隨著腫瘤細胞的增生，形成新的轉移灶，完成轉移過程。RON可能通過干預上述步驟參與乳腺癌的侵襲與轉移過程。

2.1 RON在乳腺癌中的異常表達

在乳腺組織中，RON在正常乳腺上皮細胞和良性乳腺損傷(腺瘤和乳頭狀瘤)中相對低表達，而在近50%各種組織分型的原發(fā)乳腺癌中異常高表達，并與疾病的發(fā)展階段和絕經(jīng)后狀態(tài)有關聯(lián)。但RON突變與乳腺癌沒有關聯(lián)，表明野生型RON蛋白的過表達足以促成腫瘤的生長和進展[3]。在乳腺上皮中過表達野生型RON或組成性激活RON受體的轉基因小鼠中，乳腺組織RON表達顯著提高，經(jīng)過12周出現(xiàn)增生表型。RON過表達程度足以誘發(fā)乳腺細胞轉化，并伴有高度轉移，在超過86%轉基因小鼠的肝、肺中發(fā)現(xiàn)轉移灶，并且發(fā)現(xiàn)RON過表達導致了受體磷酸化，并伴有酪氨酸磷酸化的β-連環(huán)蛋白水平升高和與人類乳腺癌不良預后有關的細胞周期素D1和c-myc基因上調[11]。RON過表達的原因現(xiàn)在還未知。MSP和RON所在的3p21基因區(qū)在癌癥中經(jīng)常改變，這個基因區(qū)在包括乳腺癌在內的多種腫瘤和癌癥細胞系中發(fā)生基因擴增[3]，表明基因擴增可能會促進MSP或RON在乳腺癌中的過表達。和上述結論一致的是MSP也在高達20%的早期人類乳腺腫瘤中過表達[12]。在體外生長的乳腺癌細胞中，RON過表達導致癌細胞的增殖、遷移和通過基底膜的侵襲能力增強，并抑制細胞凋亡和失巢凋亡(指細胞通過與基底膜或ECM的分離而發(fā)生凋亡的過程)。這表明RON表達增加與磷酸化狀態(tài)和侵襲活性強烈相關，提示RON異常表達在人類乳腺癌向侵襲-轉移演進中起作用。而且，RON過表達是乳腺癌遠處再發(fā)的一個獨立指標；在無淋巴結轉移的乳腺癌患者中RON和c-MET共表達者10年生存率僅為11.8%，遠低于RON-/c-MET-者(79.3%)，這表明RON和c-MET協(xié)同表達可能促進乳腺癌的進展[13]。有研究表明細胞周期檢驗點激酶2(cell cycle checkpoint kinase 2，CHEK2)(對于小鼠是Chk2)的多態(tài)變異體，Chk2*1100delC，導致基因組不穩(wěn)定，并與乳腺癌危險性增高有關，在Chk2*1100delC作用基礎上的RON過表達使乳腺腫瘤進展加快，受體酪氨酸激酶和一個細胞周期的調節(jié)物Cdc25A介導的信號通路能加快體內腫瘤發(fā)生[14]。

2.2 RON促進乳腺癌侵襲與轉移的可能機制

2.2.1 RON變異體與乳腺癌

癌癥細胞中RON表達變化常常伴隨通過選擇性前-mRNA剪接、蛋白平截或選擇性轉錄而導致RON變異體生成[15]，這是RON蛋白呈現(xiàn)多樣性的原因。目前已經(jīng)在各種原發(fā)癌樣本和已建的腫瘤細胞系中鑒定出9種RON變異體，根據(jù)其分子量分別命名為RON△170、RON△165、RON△165.e11p、RON△160、RONE5/6in、RON△155、RON△p110、RON△85和RON△55[15-17,18]。

RON△165，RON△160和RON△155以野生型相對高頻率地表達于乳腺癌等腫瘤中。RON△165是由RON β鏈的胞外區(qū)第四個IPT結構域框內缺失外顯子11編碼的49個氨基酸而形成的。這一缺失阻礙了蛋白溶解過程，導致單鏈原-RON△165在胞漿里積蓄。RON△165能夠組成性磷酸化，雖然不具有細胞轉化活性，但是在轉化細胞中能誘導能動的侵襲性表型形成。RON△165.e11p是由外顯子11缺失了前40個氨基酸后產(chǎn)生的，與RON△165的不同在于第四個IPT功能區(qū)上的9個固定的氨基酸，與RON△165均為存在于細胞質中的單鏈蛋白，均無法發(fā)育成熟為雙鏈受體，均能在體內自發(fā)地形成低聚體，導致結構上的磷酸化和下游信號蛋白如Erk1/2的激活。盡管缺乏細胞轉化活性，RON△165和RON△165.e11p介導上皮細胞向間充質細胞的過渡，即上皮-間質轉換(epithelial to mesenchymal transition，EMT)。此外，RON△165或RON△165.e11p在乳腺癌MCF-7細胞中的表達能減少上皮細胞表型，增加自動侵襲活性[16]。

RON△160和RONE5/6in可見于乳腺癌Du4475細胞系中，是RON β鏈胞外區(qū)第一個IPT單位內分別發(fā)生缺失和插入形成的，都經(jīng)蛋白水解作用形成雙鏈受體并表達在細胞膜上。RON△160是外顯子5和6編碼的109個氨基酸結構內缺失而形成的，這個缺失引起RON結構改變，通過酪氨酸殘基磷酸化而組成性激活，對于胰蛋白酶樣酶有抵抗作用，并能耐受抗-RON抗體介導的受體內在化，因而有助于維持細胞內信號級聯(lián)，促進在體外的細胞轉化和在體內的腫瘤生長[15]。而RONE5/6in是RON β鏈胞外區(qū)第一個IPT單位外顯子5和6編碼產(chǎn)物間插入了20個氨基酸而形成的，其活化需要配體刺激，易經(jīng)蛋白酶形成RON△p110這種平截變異體，并且是RON△p110形成的主要來源。RONE5/6in在抗-RON抗體治療時迅速內在化，導致下游信號減弱。盡管配體介導的RONE5/6in激活可以引起EMT，卻是RON△160在細胞灶形成和非依賴性貼壁生長中表現(xiàn)出細胞轉化活性[17]。RON△160介導的EMT也與細胞移動/侵襲能力增強有關。RON△p110是在RON β鏈胞外區(qū)上的Arg631-Lys632殘基處由于蛋白水解作用平截產(chǎn)生的，失去了全部SEMA區(qū)和PSI結構域和部分第一個IPT結構域。RON△p110組成性活化，出現(xiàn)在過表達RON的腫瘤細胞膜上[15]。RON△p110在細胞轉化和腫瘤形成中的作用目前尚在研究中。

RON△155是RON β鏈的胞外結構域框內缺失由外顯子5、6和11編碼的158個氨基酸而形成的。盡管以未加工的單鏈形式被保留在細胞漿里[15]，RON△155組成性激活并具有與RON△160類似的細胞轉化和致腫瘤活性。

RON△55也稱作短型RON，是由RON基因的外顯子11編碼的Met913替代激活產(chǎn)生的，和RON基因啟動子遠端區(qū)域的超甲基化有關[19]。在人乳腺癌細胞中，RON△55能調節(jié)E-鈣粘蛋白表達，從而引起腫瘤演進。RON△55沒有細胞轉化活性，但能增強細胞生長和遷移[15]。

RON△170和RON△85這兩種變異體具有針對RON和上述變異體的拮抗活性。RON△170是由激酶結構域外顯子19編碼的46個氨基酸缺失而形成的，導致閱讀框漂移，在nt3998產(chǎn)生一個終止密碼子，具有顯性的陰性抑制劑作用，在結腸癌細胞中能抑制有致癌性的變異體RON△160介導的腫瘤形成活性[20]。RON△85是由乳腺癌細胞系RON基因的外顯子5和6之間插入49個核苷酸得到的mRNA轉錄產(chǎn)物產(chǎn)生的，也造成閱讀框漂移，產(chǎn)生終止密碼子，造成細胞外β鏈不完整。RON△85與MSP直接結合，形成MSP-RON△85復合體，并抑制RON磷酸化。RON△85還干擾RON、RON△160的二聚化過程，阻礙它們磷酸化，并減弱下游信號。在結腸癌和胰腺癌細胞中，RON△85抑制自發(fā)的或MSP介導的Erk1/2和AKT磷酸化以及細胞遷移，導致細胞增殖減弱和集落形成。RON△85是一種MSP-RON通路的拮抗劑，對于RON/RON△160介導的致腫瘤活性有潛在的調節(jié)作用[18]。

上述這些極度活躍的變異體大多有通過不同底物特異性和磷酸化的方式激活多種信號級聯(lián)反應的能力。它們調節(jié)細胞遷移、侵襲和增殖，促進侵襲表型形成和腫瘤演進的同時，也促進針對干擾配體結合的藥物的耐藥性產(chǎn)生，在RON靶向治療中造成了障礙[15]。

2.2.2 RON促進細胞遷移

腫瘤基質侵襲之前的細胞遷移是上皮細胞分化、生長和生存的重要步驟。綜合上述RON變異體的特性，RON、RON△165、RON△165.e11p和RONE5/6in都能引起EMT，導致上皮細胞由立方形向紡錘形的形態(tài)學改變。上皮細胞E-鈣粘蛋白表達減少，神經(jīng)鈣粘素、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白表達增加，使得上皮源性腫瘤細胞易從原發(fā)部位脫落，移動能力加強，進而腫瘤細胞侵襲和轉移能力增強[14, 15]。轉化生長因子β(TGF-β)和肝細胞生長因子(HGF)也可以誘導EMT發(fā)生。RON通過TGF-β和MSP作用誘導EMT的過程可以被PD98059抑制。

2.2.3 RON促進腫瘤細胞附著

研究表明RON在乳腺上皮細胞中的表達增加可促進細胞膜表面透明質烷(hyaluronan，HA)表達，并導致HA介導的細胞附著增強。透明質烷對于MCF-10A型乳腺上皮細胞與多聚賴氨酸在玻璃蓋玻片上形成連接意義很大，但對細胞播散過程沒有促進作用[9]。早先的數(shù)據(jù)提示Src激酶對于10A細胞粘附后播散很重要，而與10A型乳腺上皮細胞的附著意義不大，而Src激活也不是HA在這些細胞中的產(chǎn)生的必要條件。現(xiàn)在，有越來越多的實驗結果表明顯著的炎癥過程促進腫瘤的進展[21]。而且有研究表明，HA在包括人類腫瘤在內的炎癥性疾病中起關鍵作用[22]。這種ECM對RTK信號的影響程度仍在積極研究中。

2.2.4 RON促進腫瘤生長和血管生成

血管生成(angiogenesis)是腫瘤賴以生長、轉移的基礎。RON的激活在多種腫瘤中可導致血管的形成。在上皮癌細胞系中研究RON活性揭示了其在細胞增殖、存活、遷移和EMT中的作用[7]。在小鼠模型中通過MSP過表達[12]或RON過表達[11]來激活RON足以增強腫瘤生長以及轉移頻率和組織親和性，MSP/RON的過表達與乳腺癌患者的腫瘤轉移增強和死亡有顯著關聯(lián)[12]。相反，在小鼠乳腺癌模型中，RON功能缺失則會影響腫瘤生長、血管形成和轉移。RON酪氨酸激酶結構域缺失(Ron TK-/-)時MMTV-PyMT乳腺癌模型中乳腺腫瘤生長減慢，MMTV-PyMT乳腺癌模型唯一的轉移位置——肺轉移發(fā)生率明顯降低。上述效應與腫瘤脈管系統(tǒng)的減少和凋亡增強平行出現(xiàn)[3]?？傊?，RON活性的喪失會削弱腫瘤生長、減少腫瘤轉移的可能性，并且應用RON抑制劑的臨床前期研究已經(jīng)顯示出有前景的結果。

2.2.5 RON在溶骨性骨轉移中的作用

RON還可以表達于破骨細胞。表達MSP/RON的乳腺癌病人出現(xiàn)明顯的向肺、肝、腦和骨的轉移，其中骨轉移最常見。體外人骨髓細胞分化時，RON表達在多核破骨細胞樣細胞的表面，MSP激活破骨細胞，導致骨的再吸收[23]。在小鼠模型中MSP誘導的骨轉移是溶骨性的，這和在人類乳腺癌病人中發(fā)生的是一樣的。在體內，RON在成骨細胞表面高度表達，但似乎在骨發(fā)育中沒有重要作用，因為RON功能缺失的小鼠沒有出現(xiàn)明顯骨質缺損。MSP在破骨細胞激活中的作用與乳腺癌高度相關，因為70%～80%的乳腺癌病人會發(fā)生骨轉移，因此骨是該病轉移的最常見部位[24]。表達MSP的乳腺癌細胞在體外激活破骨細胞，導致骨基質被侵蝕，其程度遠遠大于由未表達MSP的對照組腫瘤誘導的情況。此外，具有MSP表達的乳腺癌的小鼠會出現(xiàn)自發(fā)性溶骨性骨轉移，有高度MSP/RON表達的乳腺癌患者比起MSP/RON表達較低的患者更易發(fā)生骨轉移[12]。MSP/RON信號轉導通路在乳腺癌骨轉移中的作用還有待闡明，可能有重要的臨床意義。

3 RON靶向治療在乳腺癌治療中的潛在價值

使用鼠模型和原發(fā)性人乳腺癌樣本獲得的數(shù)據(jù)強烈表明RON相關的信號轉導通路是治療乳腺癌的新靶點。MSP/RON不僅在腫瘤發(fā)生和進展中起作用，也在各種已知發(fā)生于腫瘤微環(huán)境的炎癥反應中起關鍵作用。動物實驗顯示，通過限制腫瘤炎癥能明顯限制甚至消除腫瘤進展和轉移[25]。IMC-41A40和Zt/f2等RON特異性mAb能抑制RON與受體相互作用，使RON表達下調并抑制配體誘導的磷酸化，能降低腫瘤生長速度達50%以上，都還處在臨床前期階段[26]。體內試驗發(fā)現(xiàn)與5-氟尿嘧啶(5-FU)等細胞毒作用藥物合用的Zt/f2能增強前者的腫瘤細胞殺傷作用，并伴隨半抑制濃度值(IC50值)的顯著下降[27]。有10多種c-MET/RON特異性的小分子抑制物(small-molecule inhibitors，SMIs)正在進行各期臨床試驗。大多數(shù)SMIs都是靶向c-MET的，其中比較有代表性的是ARQ107和PF-02341066。由于RON和c-MET的激酶結構域有68%是相同的，所以c-MET抑制劑往往體現(xiàn)對c-MET和RON的雙重抑制，只有IC50的略微差異[26]，如Compound I能以不同IC50分別抑制c-MET和RON，最近也研制出如Compounds 4和Compounds 13的RON特異性SMIs[28]。但是，SMIs的臨床應用上還存在問題，一是c-MET和RON的表達改變常共存于在各種腫瘤中，僅特異作用于RON的SMIs的臨床可行性還需要進一步探討；二是體外實驗顯示，腫瘤細胞對某些SMIs如PF-02341066和Compound I的獲得性耐藥性的出現(xiàn)[29]，原因可能為c-MET與EGFR家族成員的交流導致腫瘤細胞逃逸SMI介導的細胞毒及抑制作用，或是缺氧誘導的c-MET/RON表達下調促進了對c-MET/RON雙重抑制劑Compound I的耐藥性獲得。有關SMIs耐藥性產(chǎn)生的具體機制的研究還在繼續(xù)。在動物模型中已經(jīng)證實，通過特殊的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)使RON表達沉默能抑制腫瘤生長[30]。存在c-MET/RON基因擴增和蛋白過表達的結腸癌細胞在經(jīng)過siRNA治療后會產(chǎn)生生長抑制、G1-S停止和凋亡。另外有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素介導的RON表達抑制也可以阻斷MSP誘發(fā)的乳腺癌細胞侵襲。數(shù)據(jù)顯示姜黃素通過影響NF-κB p65亞單位蛋白表達和轉錄活性來降低乳腺癌細胞系中RON表達[30]，從而阻斷RON介導的癌細胞侵襲。

4 展 望

MSP/RON信號轉導通路有對腫瘤和宿主免疫系統(tǒng)的雙重作用。而在動物模型上的臨床前期試驗中常規(guī)使用免疫缺陷小鼠，是抗腫瘤藥物發(fā)展的一個障礙。如果MSP/RON信號轉導通路是通過改變免疫功能來促進腫瘤進展和轉移，就很難或者說不可能在這樣一個模型中觀察到結果[3]。另一個挑戰(zhàn)是RON存在多種極度活躍的剪接變異體，RON各種活化形式的上調促進針對干擾配體結合的藥物的耐藥性產(chǎn)生，再加上c-MET/RON特異性SMIs的獲得性耐藥性的出現(xiàn)，在RON靶向治療中造成了障礙。因此，在乳腺癌治療中，RON靶向治療面臨一定的挑戰(zhàn)，但也很有成功的希望。

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