巴戟天多糖對(duì)肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞中 MCP-1、IL-8蛋白表達(dá)的影響

劉 琛 赫長勝 (山東大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 25002)

南藥巴戟天(Morinda officinalis How)為我國傳統(tǒng)名貴中藥,具有抗抑郁、抗衰老、抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)活性〔1〕。現(xiàn)代研究資料表明巴戟天富含豐富的營養(yǎng)成分〔2〕,例如 VC、糖分及膠質(zhì)以及人體所需要的有機(jī)物質(zhì)。藥理研究表明,巴戟天提取物巴戟天多糖有較顯著的免疫增強(qiáng)作用〔3〕。本研究的目的在于觀察巴戟天多糖對(duì)肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞中單核細(xì)胞超化蛋白(MCP)-1、白介素(IL)-8蛋白表達(dá)的影響,闡述巴戟天多糖對(duì)細(xì)胞的免疫作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株來源 肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞由北京肝病醫(yī)院中心提供。主要由SV 40轉(zhuǎn)染 prague dauley大鼠星狀細(xì)胞組成,其表型為活化的肝星狀細(xì)胞(HSC),表達(dá)較高水平的 I型膠原、TIMP-1等。進(jìn)行細(xì)胞學(xué)常規(guī)復(fù)蘇、傳代之后,放于 5.0%CO2飽和條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),備用。

1.1.2 試劑及耗材 培養(yǎng)基 DMEM、胰酶(美國Gibco公司)。標(biāo)準(zhǔn)的胎牛血清(北京鼎國公司),其余試劑均為國產(chǎn)的分析純。 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(北京生物公司),SP染色劑、MCP-1、IL-8單克隆抗體(中山金橋公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱,多普勒顯微鏡等。

1.1.4 巴戟天多糖的提取〔4〕取巴戟天粗品,粉碎,將藥材烘干后,準(zhǔn)確稱取 500g,加入與體重多 10倍量的水,浸泡 30 min后,沸水浴 60 min,取溶液過濾,濾液中加入 3倍體積的乙醇,靜置過夜,將乙醇濾出后收集沉淀,干燥后為巴戟天粗多糖。將粗多糖溶解于適量的蒸餾水中,采用Sevag方法將蛋白去除(重復(fù)操作 3次),加入乙醇使得濃度為 80.0%,靜置過夜后,將沉淀收集。無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌,干燥。將沉淀物溶于蒸餾水,加入乙醇至溶液濃度為 70.0%,靜置過夜,濾過,用 70.0%乙醇反復(fù)淋洗,沉淀干燥,即得到巴戟天多糖純品。

1.2 方法

1.2.1 藥物血清的制備 青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心藥理所提供純種的雄性 Begile犬,將巴戟天多糖純品溶解后灌胃給藥,劑量為 2.0 ml/kg(相當(dāng)于成人用量的 10倍)。給藥 2.5 h后,真空抗凝管抽取血液,離心,3 000r/min,離心3.0min,取上清液,加入巴戟天多糖,同時(shí)制備為血清,滅活后放于-20℃冰箱中冷凍備用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 基本培養(yǎng)基的配制:DMEM培養(yǎng)基采用三蒸水溶解,加入 3.0 g/L的 NaHCO3,2.5 g/L的 Hepes(經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌),5℃保存。完全培養(yǎng)基的配制:90.0%的基本培養(yǎng)基,10.0%的標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,鏈霉素10萬 U/L。含藥培養(yǎng)基的配制:將采集的藥物血清與含有5.0%標(biāo)準(zhǔn)胎牛的基本培養(yǎng)基配制成 2.5%濃度的藥物血清。

1.2.3 肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37.5℃、5.0%CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞生長密度為1.0×105～ 1.0×106后,按照 1∶3進(jìn)行傳代。

1.2.4 給藥方式 取對(duì)數(shù)生長期的肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞,用0.1%胰酶和 EDTA的混合液進(jìn)行消化,用完全培養(yǎng)基將肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞懸液調(diào)至 2.0×104/ml,接種于 96孔板中,每孔200μl。培養(yǎng) 24 h后加入乙醛達(dá)到終末濃度,造離體模型并更換含藥的培養(yǎng)基,持續(xù)培養(yǎng) 72 h,同時(shí)每板有 3個(gè)孔常規(guī)培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞作為空白對(duì)照組。72 h后,采用 5.0%多聚甲醛固定,干燥后備用。

1.3 細(xì)胞免疫組化 經(jīng)冷 PBS漂洗后,120 g/L甲醇固定,再經(jīng) PBST漂洗,1.0%Triton-X 100修復(fù),暴露抗原,冷 PBST沖洗,3.0%甲醇-過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水漂洗,100ml/L山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn),棄去血清后,分別滴加 MCP-1、IL-8單克隆抗體,5.0℃靜置過夜,同時(shí)采用正常血清代替 I抗作為陰性對(duì)照。3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色15～20 min,乙醇逐級(jí)脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。最后置于顯微鏡下觀察,照像并分析圖像,每片截取 5個(gè)視野分析陽性信號(hào)的面密度,取平均值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,組間比較采用獨(dú)立樣本的 t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析或 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

模型組肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞中MCP-1、IL-8蛋白表達(dá)較正常組減少(P＜0.05),經(jīng)藥物血清培養(yǎng)后的肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞中MCP-1及 IL-8的表達(dá)均較模型組增強(qiáng)(P＜0.05)。見表 1。

表1 巴戟天多糖對(duì) MCP-1、IL-8蛋白表達(dá)的影響(±s)

表1 巴戟天多糖對(duì) MCP-1、IL-8蛋白表達(dá)的影響(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 MCP-1 IL-8正常組 面積度(×10-3) 3.64±1.12 1.25±0.56吸光度(A) 0.154 6±0.001 2 0.112 5±0.000 5模型組 面積度(×10-3) 22.64±6.981) 13.25±7.341)吸光度(A) 0.107 8±0.002 31) 0.098 7±0.000 91)藥物血清組 面積度(×10-3) 13.12±1.471)2) 6.53±1.141)2)吸光度(A) 0.257 4±0.003 11)2)0.210 4±0.002 11)2)

3 討 論

近年來,隨著人們對(duì)于多糖生物學(xué)功能的深入認(rèn)識(shí),各種天然產(chǎn)物中提取的生物活性多糖的研究又一次成為人們關(guān)注的重中之重,目前已經(jīng)有 300多種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離提取出來,其中在植物中,尤其是從中藥中提取的水溶性多糖最為重要〔5〕。巴戟天即為其中最重要的一種中藥材?，F(xiàn)代研究也表明巴戟天中的營養(yǎng)成分較豐富,糖類物質(zhì)的總量已經(jīng)達(dá)到了 49.79% ～58.25%〔6〕。

HSC活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心事件,同時(shí)淋巴細(xì)胞作為肝纖維化局部微環(huán)境中的一個(gè)主要的浸潤細(xì)胞,對(duì)纖維化進(jìn)程具有重要的免疫調(diào)控作用。具體表現(xiàn)在,活化的 HSC可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的浸潤及其在組織局部的存活;另外,淋巴細(xì)胞可以通過細(xì)胞間直接接觸或旁分泌兩種方式影響HSC的促纖維化功能。HSC主要通過旁分泌,即HSC可以分泌MCP-1、IL-8、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α等多種趨化因子〔7〕,其中 MCP-1幾乎全部是由 HSC合成,具有較強(qiáng)的趨化單核細(xì)胞的能力,是慢性炎癥時(shí)重要的趨化信號(hào)〔8〕。

因此,本實(shí)驗(yàn)選取與淋巴細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)的 MCP-1、IL-8蛋白〔9〕進(jìn)行研究,探討巴戟天多糖對(duì)星狀細(xì)胞促進(jìn)免疫的作用機(jī)制。巴戟天多糖刺激 HSC增殖與藥物的濃度有一定的關(guān)系,在體內(nèi)巴戟天多糖可以通過刺激 HSC的不斷增殖而促進(jìn)對(duì)淋巴細(xì)胞的作用,增進(jìn)免疫系統(tǒng)的功能〔10〕。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),乙醛刺激可以使HSC激活增殖,經(jīng)巴戟天多糖的藥物血清培養(yǎng)后,MCP-1、IL-8基因蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。

綜上所述,巴戟天多糖在一定程度上可以促使 HSC增殖,其給藥血清中肝星狀細(xì)胞片細(xì)胞中的 MCP-1、IL-8表達(dá)較模型組細(xì)胞顯著增多,巴戟天多糖可能通過影響 MCP-1、IL-2等基因的表達(dá),對(duì)免疫功能起到一定的調(diào)節(jié)作用。

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