羅格列酮在人結(jié)腸癌氟尿嘧啶化療增敏作用中對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

胡嘯玲 湯恢煥 周志剛 尹 峰 劉文捷 (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院,湖南 衡陽(yáng) 4200)

大腸癌是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,對(duì)化療敏感性低、多藥耐藥致晚期腫瘤死亡率高,故尋找高效、毒副作用小的大腸癌耐藥逆轉(zhuǎn)方法具有重要社會(huì)效益和廣闊臨床應(yīng)用前景。研究報(bào)道過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體 γ(PPARγ)配體羅格列酮(ROZ)抗腫瘤機(jī)制有:①誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔1〕;②改變細(xì)胞周期〔2〕;③誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化〔3〕;④抑制環(huán)氧合酶 2(COX-2)表達(dá)〔4〕;⑤誘導(dǎo)腫瘤抑制基因酪氨酸磷酸酶蛋白(PTEN)表達(dá)上調(diào)〔5〕;⑥調(diào)節(jié)醛脫氫酶 3(ALDH3)表達(dá)〔6〕;⑦調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫〔7〕;⑧抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá);⑨抑制腫瘤新生血管形成等〔8〕。本文通過(guò)觀察 ROZ和 5-氟尿嘧啶(5-Fu)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系 HT-29細(xì)胞的體外誘導(dǎo)凋亡作用以及在無(wú)細(xì)胞毒作用濃度下 ROZ和 5-Fu聯(lián)合用藥時(shí)的化療增敏作用,初步探討其誘導(dǎo)體外培養(yǎng) HT-29細(xì)胞凋亡及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HT-29細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物中心。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、PPARγ、Bcl-2、Bax購(gòu)自邁新生物技術(shù)有限公司;聚丙烯酰胺凝膠電泳所用各種分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自Amreco公司;流式細(xì)胞儀,Beckerman coulter EPICS-XL;圖像分析系統(tǒng)(PIPS-2020),重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AO/EB熒光染色顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化,制成單細(xì)胞懸液,接種于 50 ml培養(yǎng)瓶中,每瓶4.5ml細(xì)胞懸液,含 HT-29細(xì)胞 4×107個(gè)。細(xì)胞置 37℃、95%濕度、含 5%CO2培養(yǎng)箱孵育 12 h后取出,ROZ組加入 0.5 ml不同濃度的 ROZ溶液,使各組 ROZ終濃度分別為 1.0、10.0、100.0μmol/L;ROZ與 5-Fu聯(lián)合組加入 0.25 ml ROZ(終濃度為 1.0μmol/L)溶液和 0.25 ml不同濃度的 5-Fu溶液,使 5-Fu溶液終濃度分別為 3.0、6.0、12.0μg/L;環(huán)胞素A(CsA)與 5-Fu聯(lián)合組加入 0.25 ml CsA(終濃度為 50 ng/ml)溶液和 0.25 ml的 5-Fu溶液(終濃度 6.0μg/L);5-Fu組加入 0.5 ml不同濃度的 5-Fu溶液,終濃度分別為 3.0、6.0、12.0μg/L;對(duì)照組換等量培養(yǎng)基,培養(yǎng) 24h。以胰酶消化,收集約 1×107個(gè)細(xì)胞,離心棄上清液加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗 3次,制成細(xì)胞懸液,吸95μl細(xì)胞懸液加入 5μl吖啶橙(AO)染液,充分混勻,滴于玻片上,分別計(jì)數(shù)。細(xì)胞凋亡率(%)=〔(早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞)/全部細(xì)胞〕×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,棄去舊培養(yǎng)基,以胰酶消化,制成單細(xì)胞懸液,接種于50 ml培養(yǎng)瓶中,每瓶 4.5 ml細(xì)胞懸液,含 HT-29細(xì)胞 4×107個(gè)。細(xì)胞置 37℃,95%濕度,含 5%CO2培養(yǎng)箱孵育 12 h后取出。進(jìn)行分組處理,其分組、各組液體的濃度與 1.2.1相同,對(duì)照組換等量培養(yǎng)基,培養(yǎng) 24 h后,收集 1×106以上細(xì)胞,PBS洗 2遍,棄上清液,用 75%乙醇固定,過(guò)夜,PBS洗 3次后,經(jīng)0.5g/L的 RnaseA消化 30 min,終濃度 65 mg/L的碘化丙啶(PI)染色 1 h后流式細(xì)胞儀(型號(hào)為 FACS420)測(cè)定,分析細(xì)胞周期,計(jì)算凋亡率。

1.2.3 Western印跡分析 觀察 ROZ處理 HT-29后 PPARγ、NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),加 ROZ及 PPARγ特異阻斷劑白楊素(陽(yáng)性對(duì)照藥)處理。作量效關(guān)系研究時(shí)用 Roz(終濃度為 1.0,10.0,100.0μmol/L)分別處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HT-29細(xì)胞,培養(yǎng) 12 h后收集細(xì)胞;作時(shí)效關(guān)系研究時(shí)用 10.0μmol/L的ROZ分別處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HT-29細(xì)胞,0、4、8、12 h后收集細(xì)胞。以冷 PBS洗 2次,濾紙吸干,加入適量的裂解液置于冰上孵育 30 min,細(xì)胞刮收集細(xì)胞于EP管,4℃離心,12 000 r/min×10 min,上清液即為細(xì)胞總蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)試劑進(jìn)行蛋白定量。調(diào)節(jié)每份樣品濃度,以每孔 20μg的蛋白量上樣,樣品加入等體積的 2×十二烷基硫酸鈉(SDS)加樣緩沖液,沸水煮沸 10 min,根據(jù)不同蛋白分子量用不同濃度的 SDS-聚丙烯凝膠(PAGE)電泳后轉(zhuǎn)膜,加入相應(yīng)的Ⅰ抗、Ⅱ抗孵育,用辣根過(guò)氧化物酶-電化學(xué)熒光法(HRP-ECL)顯影壓片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,one-way ANOVA和 t檢驗(yàn)法分析,數(shù)值用±s表示。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞儀分析ROZ、5-Fu對(duì) HT-29細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

2.1.1 ROZ對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)顯示HT-29細(xì)胞的自然凋亡率為(1.82±0.26)%,1.0μmol/L的 ROZ并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)表 1。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROZ對(duì) 5-Fu誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡的影響(±s,n=3,%)

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROZ對(duì) 5-Fu誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡的影響(±s,n=3,%)

與 5-Fu組比較:1)P＜0.01

組別 凋亡率(%)5-Fu 5-Fu+1.0μmol/L ROZ 5-Fu 0μg/ml組 1.82±0.26 1.60±0.21 5-Fu 3.0μg/ml組 20.7±0.46 28.1±0.701)5-Fu 6.0μg/ml組 23.67±0.43 32.67±0.451)5-Fu 12.0μg/ml組 30.34±0.97 40.26±0.731)

2.1.2 ROZ促進(jìn)5-Fu誘導(dǎo) HT-29細(xì)胞凋亡 不同濃度的 5-Fu(3.0,6.0,12.0μg/ml)與細(xì)胞作用 72 h后,一定程度上誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡,但與 ROZ(1.0μmol/L)合用時(shí),其凋亡率均有增加。見(jiàn)表 1,圖 1。

2.1.3 ROZ聯(lián)合不同濃度 5-Fu對(duì)HF-29細(xì)胞凋亡周期的影響 見(jiàn)表 2。

2.2 AO/EB熒光染色法檢測(cè)ROZ對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響HT-29細(xì)胞的自然凋亡率為(1.43±0.25)%。1.0、10.0、100.0μmol/L的 ROZ作用 72 h后凋亡率分別為(1.44±0.07)%,(2.34±0.23)%,(14.13±1.36)%。此結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)所檢測(cè)結(jié)果一致。

2.3 AO/EB熒光染色法檢測(cè) ROZ與 5-Fu合用時(shí)對(duì) HT-29細(xì)胞凋亡的影響 當(dāng)1.0μmol/L ROZ作用 72 h后,HT-29細(xì)胞的凋亡率為(1.44±0.07)%,與二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組細(xì)胞凋亡率〔(1.15±0.13)%〕無(wú)明顯差異,提示 1.0μmol/L ROZ無(wú)誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡作用。5-Fu(3.0、6.0、12.0μg/ml)組的凋亡細(xì)胞率分別為(13.91±0.38)%,(18.16±0.42)%,(23.14±2.69)%,當(dāng) 1.0μmol/L ROZ聯(lián)合不同濃度的 5-Fu(3.0、6.0、12.0μg/ml)處理 HT-29細(xì)胞,其凋亡率分別為(27.35±0.86)%,(33.89±1.16)%,(38±1.62)%。凋亡細(xì)胞較單用 5-Fu明顯增加(P＜0.01)。CsA(5 ng/ml)組、5-Fu(6.0μg/ml)+CsA(5 ng/ml)+ROZ(1.0μmol/L)組凋亡率分別為(1.21±0.20)%、(38.62±1.05)%。

熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞,正常形態(tài)飽滿,細(xì)胞質(zhì)呈綠色,核染色為亮綠色,核形態(tài)較為規(guī)則,均為圓形或橢圓形;5-Fu(6.0μg/ml)、ROZ(1.0μmol/L)和 5-Fu(6.0μg/ml)聯(lián)合 ROZ(1.0μmol/L)分別處理 72h的 HT-29細(xì)胞可見(jiàn)部分細(xì)胞體積明顯變小,細(xì)胞外形皺折,結(jié)構(gòu)模糊,呈致密濃染的桔黃色或紅色熒光,可見(jiàn)細(xì)胞胞漿減少、細(xì)胞核染色質(zhì)固縮偏向一邊,核碎裂和核裂解為質(zhì)膜包繞的碎片,細(xì)胞膜完整,表面有牙狀突起等凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,并可見(jiàn)細(xì)胞碎片。凋亡率以 5-Fu聯(lián)合 ROZ組最高,呈劑量依賴性。見(jiàn)圖 1。

2.4 Western印跡法測(cè)定 ROZ對(duì) HT-29細(xì)胞 PPARγ、NF-κB、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 3.0μmol/L的 ROZ處理 HT-29細(xì)胞4 h后 PPARγ表達(dá)上調(diào),NF-κB表達(dá)下調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào),呈時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖 2。1.0,10.0,100.0μmol/L ROZ和白楊素 100.0μmol/L分別處理 HT-29細(xì)胞 12 h,PPARγ和 Bax蛋白表達(dá)上調(diào),NF-κB和 Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)、Bcl-2/Bax比例下降,呈濃度依賴性。與空白對(duì)照組比較,有顯著性差異(P＜0.05)。而使用 PPARγ特異阻斷劑白楊素后,上述作用即可逆轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖 3、圖 4,表 3～表 5。

圖1 AO/EB熒光染色熒光顯微鏡觀察 ROZ與5-Fu合用誘導(dǎo) HT-29細(xì)胞凋亡作用(×400)

表2 羅格列酮聯(lián)合不同濃度 5-Fu(μmol/L)對(duì) HT-29細(xì)胞凋亡周期的影響

表3 羅格列酮(3.0μmol/L)對(duì) HT-29細(xì)胞不同時(shí)間各組蛋白表達(dá)的影響

表4 不同濃度羅格列酮對(duì)HT-29細(xì)胞各組蛋白表達(dá)的影響

表5 PPARγ阻斷劑白揚(yáng)素與不同濃度 ROZ相互作用后對(duì) HT-29細(xì)胞 Bcl-2/PPARγ蛋白表達(dá)的影響

圖2 HT-29細(xì)胞不同時(shí)間 Bax、Bcl-2、NF-κB、PPARγ蛋白表達(dá)的影響

圖3 不同濃度 ROZ對(duì) HT-29細(xì)胞 PPARγ、Bax、NF-κB、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖4 PPARγ阻斷劑與不同濃度ROZ相互作用后對(duì) HT-29細(xì)胞 Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 ROZ對(duì)HT-29細(xì)胞的作用及可能機(jī)制 PPAR是 1990年發(fā)現(xiàn)的一類與甲狀腺激素和維甲酸受體密切相關(guān)的核激素受體,可分為 PPARα、PPARβ、PPARγ三個(gè)亞族〔9〕。其中生物學(xué)功能最復(fù)雜和研究最多的是 PPARγ。近年來(lái)大量研究〔10,11〕發(fā)現(xiàn) PPARγ在多種腫瘤組織及其癌旁組織中均有表達(dá),如肺、乳腺、前列腺及消化道腫瘤及其癌旁組織中,PPARγ配體能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而起到對(duì)腫瘤的化學(xué)預(yù)防和治療作用。因此,本文用 PPARγ合成配體 ROZ作用于體外培養(yǎng)的 HT-29細(xì)胞,觀察其對(duì)HT-29細(xì)胞的凋亡影響,并通過(guò)對(duì)相關(guān)的分子生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè),初步探討其作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò) FCM分析、AO熒光染色法及 Western印跡證實(shí) PPARγ的配體 ROZ對(duì) HT-29細(xì)胞有促進(jìn)凋亡作用。FCM周期分析顯示,ROZ能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞調(diào)亡,呈劑量依賴性,它使 HT-29細(xì)胞阻滯于G1期。同時(shí)通過(guò) Western印跡法對(duì)與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的一些基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,ROZ作用后,HT-29細(xì)胞的 PPARγ蛋白核內(nèi)表達(dá)上調(diào)、NF-κB蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)。這提示 ROZ對(duì)HT-29細(xì)胞所產(chǎn)生的抑制作用可能是通過(guò)二條通路實(shí)現(xiàn)的:一是影響細(xì)胞周期的進(jìn)程,二是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

NF-κB能調(diào)控許多基因表達(dá),在腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下 NF-κB位于胞質(zhì)內(nèi),呈非活性狀態(tài)與 NF-κB抑制蛋白(IκB)結(jié)合,一旦被病毒、氧化劑、炎癥細(xì)胞因子等刺激劑激活后便與IκB解離而轉(zhuǎn)入核內(nèi)與特異的啟動(dòng)子結(jié)合,從而調(diào)控基因的表達(dá)〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)〔13,14〕,NF-κB過(guò)度激活與許多病毒和非病毒的惡性腫瘤有關(guān),如肝癌、大腸癌,肺癌等,NF-κB導(dǎo)致癌癥的發(fā)生是因?yàn)榧?xì)胞因子或其受體基因轉(zhuǎn)錄的激活,阻斷了凋亡。其次 NF-κB活化可直接作用于 DNA復(fù)制或具有促進(jìn)細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)表達(dá)及 G1/S轉(zhuǎn)換功能,使細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致癌癥的發(fā)生〔15〕。體外實(shí)驗(yàn)表明抑制 NF-κB能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡〔16〕。本實(shí)驗(yàn)證明 NF-κB因子在HT-29細(xì)胞上呈激活狀態(tài),HT-29細(xì)胞經(jīng)ROZ處理后與對(duì)照組比較,NF-κB蛋白核內(nèi)表達(dá)明顯下調(diào),而 HT-29細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制,凋亡率增加。

本研究證實(shí)PPARγ蛋白在 HT-29細(xì)胞的胞漿及核膜上表達(dá),ROZ作用后,PPARγ蛋白在核內(nèi)表達(dá)明顯上調(diào),與 Chen等〔17〕人結(jié)果相一致。HT-29細(xì)胞經(jīng) ROZ處理后與對(duì)照組比較,NF-κB蛋白核內(nèi)表達(dá)明顯下調(diào)。這提示 PPARγ的合成配體 ROZ抑制 HT-29細(xì)胞增殖促進(jìn) HT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡,與激活 PPARγ受體進(jìn)而抑制 NF-κB有關(guān)。

Bcl-2基因是一種抗凋亡基因,其編碼的蛋白Bcl-2是一種結(jié)合于核膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外表面的蛋白質(zhì),Bcl-2通過(guò)改變膜對(duì)一些離子、小分子或蛋白質(zhì)的通透性而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Bcl-2可通過(guò)多種途徑起到抗細(xì)胞凋亡作用而B(niǎo)ax促進(jìn)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的數(shù)量過(guò)多會(huì)使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞,即使接受凋亡信號(hào)也不會(huì)發(fā)生凋亡〔18〕。本研究證實(shí),HT-29細(xì)胞經(jīng) ROZ處理后,與對(duì)照組比較 Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降,而 Bax蛋白表達(dá)增高,Bcl-2/Bax比值降低,HT-29細(xì)胞增殖抑制,細(xì)胞凋亡率增加。

有研究證實(shí)〔19,20〕,NF-κB通過(guò)誘導(dǎo)或上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2抑制凋亡。本研究通過(guò) Western印跡法對(duì)與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的一些基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn) ROZ作用后,HT-29細(xì)胞的 NF-κB蛋白核內(nèi)表達(dá)下調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)、Bax蛋白表達(dá)上調(diào),Bcl-2/Bax比值降低從而抑制HT-29細(xì)胞增殖,促進(jìn) HT-29細(xì)胞凋亡。這提示 HT-29細(xì)胞經(jīng) ROZ作用后,PPARγ受體活化、下調(diào) NF-κB蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào) Bcl-2/Bax比值,發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。而使用 PPARγ特異阻斷劑后,上述作用即可消失,PPARγ受體不能活化,而B(niǎo)CL-2蛋白表達(dá)上調(diào)。

3.2 ROZ增加HT-29細(xì)胞對(duì) 5-Fu的敏感性及可能機(jī)制 對(duì)化療耐藥性的研究表明,NF-κB、Bcl-2與化療耐藥相關(guān)。Bcl-2/Bax比值可作為預(yù)測(cè)腫瘤患者是否存在耐藥的一項(xiàng)指標(biāo)。另外有研究表明,NF-κB通過(guò)誘導(dǎo)或上調(diào)抗凋亡基因,能激活 B細(xì)胞淋巴瘤/Bcl-2家族中抗凋亡蛋白(AL/Bfl-1)而抑制由腫瘤壞死因子-α(TNF-α)引起的細(xì)胞凋亡〔19〕。 Chen等〔17〕人研究證實(shí):15d-PGJ2,環(huán)格列酮可顯著抑制 NF-κB表達(dá)進(jìn)而下調(diào) bcl-2的表達(dá),從而抑制HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究已證實(shí)ROZ可通過(guò)與PPARγ受體來(lái)影響一些和腫瘤耐藥有關(guān)的基因表達(dá)。Cox等〔21〕報(bào)道臨床常規(guī)劑量口服給藥后,ROZ的人體血藥峰值濃度為 1.67μmol/L。AO染色熒光顯微鏡法和FCM法結(jié)果皆顯示:ROZ、5-Fu能誘導(dǎo) HT-29細(xì)胞凋亡,呈劑量依賴性。1.0μmol/L ROZ能明顯增強(qiáng)5-Fu對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。ROZ使 HT-29細(xì)胞阻滯于 G1期,呈劑量依賴性。West印跡法顯示,ROZ作用 24 h后 HT-29細(xì)胞的 PPARγ蛋白表達(dá)明顯上調(diào),NF-κB,Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào),Bcl-2相關(guān) X蛋白(BAX)蛋白表達(dá)上調(diào),增強(qiáng) 5-Fu對(duì)HT-29細(xì)胞的增殖抑制或誘導(dǎo)凋亡作用。而 PPARγ的特異阻斷劑白楊素可以逆轉(zhuǎn)上述作用。因此認(rèn)為 ROZ可通過(guò)激活 PPARγ受體,進(jìn)而抑制NF-κB、Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào) Bcl-2/Bax比值,增敏 5-Fu對(duì) HT-29細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。

綜上所述,ROZ誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞增殖和凋亡機(jī)制之一可能與抑制腫瘤細(xì)胞NF-κB進(jìn)而抑制Bcl-2蛋白表達(dá),上調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。而 ROZ增強(qiáng)HT-29細(xì)胞對(duì) 5-Fu敏感性機(jī)制之一可能同樣與這三種凋亡相關(guān)蛋白相互作用,使大腸癌細(xì)胞重新啟動(dòng)凋亡機(jī)制有關(guān)。

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