脈沖電場(chǎng)不可逆性電擊穿在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

張 琴綜述,熊正愛(ài)審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 400010）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界每年死于腫瘤的人數(shù)多達(dá)700萬(wàn),近20年期間,惡性腫瘤的死亡率呈上升趨勢(shì),共增長(zhǎng)了29.4%；在死因中的構(gòu)成比自12.6%升至17.9%。尤其是在發(fā)展中國(guó)家,惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類(lèi)生命健康的主要疾病。傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)、化療、放療、熱療、生物治療等由于受適應(yīng)證、禁忌證和不良反應(yīng)等因素的限制,治療效果仍不理想。脈沖電場(chǎng)不可逆性電擊穿（irreversible electroporation，IRE）由于其作用時(shí)間短、非熱效應(yīng)、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、可能適用于免疫抑制者等獨(dú)特之處及其在腫瘤治療中展現(xiàn)的良好前景逐步受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注,有可能由脈沖輔助治療轉(zhuǎn)變?yōu)楠?dú)立的腫瘤局部治療手段。

1 IRE療法的來(lái)源

Sale和Hamiton[1]在1967年首次提出電場(chǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或減少的觀(guān)點(diǎn)。美國(guó)MIT學(xué)者Weaver[2]經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn),在正常的生理功能狀況下,細(xì)胞膜能較好地阻礙離子和親水分子的傳輸。但是當(dāng)施加強(qiáng)度為kv/cm、持續(xù)時(shí)間為s～ms級(jí)的電脈沖刺激細(xì)胞膜時(shí),細(xì)胞膜會(huì)出現(xiàn)微孔,同時(shí)電導(dǎo)率發(fā)生改變,這種由電脈沖產(chǎn)生的細(xì)胞膜滲透性增加被解釋為細(xì)胞膜暫時(shí)通透性結(jié)構(gòu)改變或微孔的形成,通常稱(chēng)之為可逆性電穿孔。當(dāng)增加電脈沖劑量則細(xì)胞膜出現(xiàn)不可恢復(fù)的破裂使細(xì)胞死亡時(shí),此為不可逆性電擊穿（IRE）。產(chǎn)生電穿孔后,細(xì)胞膜的滲透性極大地增強(qiáng),有利于細(xì)胞吸收藥物分子、基因物質(zhì)、蛋白質(zhì)或其他大分子等,而對(duì)細(xì)胞核等膜內(nèi)細(xì)胞器沒(méi)有任何影響。根據(jù)這個(gè)特點(diǎn),日本學(xué)者Okino和Mohri[3]創(chuàng)立了電化學(xué)療法,即采用電脈沖輔助化療藥物如博來(lái)霉素等治療腫瘤。其治療機(jī)制是一定劑量的短時(shí)電脈沖導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞膜電穿孔,使得細(xì)胞膜的電導(dǎo)率和粒子滲透作用劇增從而促進(jìn)化療藥物的運(yùn)送,這種方法只需相對(duì)較少劑量的化療藥物就能較高效、低毒性地殺死腫瘤細(xì)胞,提高了化療藥物的殺傷力。此外它還可用于腫瘤的基因療法、分子生物學(xué)上的DNA電轉(zhuǎn)染、促進(jìn)細(xì)胞電融合等。1999年Hofmann等[4]總結(jié)了將電穿孔技術(shù)成功應(yīng)用于頭頸癌治療的經(jīng)驗(yàn)。在電穿孔療法實(shí)施的30多年間,IRE可導(dǎo)致細(xì)胞死亡這一現(xiàn)象僅僅被視為可逆性電穿孔治療的不良反應(yīng)。近些年來(lái),學(xué)者們開(kāi)始將脈沖電場(chǎng)不可逆性電擊穿作為一種單獨(dú)治療手段進(jìn)行研究。若可行,這種治療不需注入藥物或其他物質(zhì),即可達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。此法簡(jiǎn)單,也免去了患者的化療痛苦及不良反應(yīng),因此具有巨大的臨床應(yīng)用前景。

2 IRE治療腫瘤的主要作用機(jī)制

2.1 不可逆性電穿孔效應(yīng) 姚成果和孫才新[5]從細(xì)胞的物質(zhì)結(jié)構(gòu)闡述為在很強(qiáng)的電場(chǎng)力作用下,細(xì)胞膜和核膜會(huì)產(chǎn)生電穿孔,周期性的陡脈沖使微孔難以愈合。其結(jié)果是有可能引起微孔量滾雪球似的增加,對(duì)細(xì)胞膜和核膜的膜結(jié)構(gòu)造成不可恢復(fù)性破壞。光鏡、電鏡的觀(guān)察結(jié)果充分證實(shí)了這種預(yù)測(cè)。Rubinsky[6]認(rèn)為細(xì)胞膜發(fā)生不可逆性電擊穿最終細(xì)胞壞死是IRE療法的主要作用機(jī)制。Yang等[7]實(shí)驗(yàn)證實(shí)瞬間高電壓脈沖刺激下,細(xì)胞膜上形成暫時(shí)、可逆性微孔,在脈沖取消后多數(shù)情況下微孔會(huì)關(guān)閉,不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響。隨著脈沖劑量的增加,細(xì)胞膜、核膜等處于不斷的充放電動(dòng)態(tài)過(guò)程,在膜及其周?chē)纬呻妶?chǎng)。細(xì)胞膜的介電常數(shù)與周?chē)|(zhì)介電常數(shù)不等,必然存在作用于膜上的電場(chǎng)力,使細(xì)胞膜厚度不斷變薄,最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆性電穿孔。

2.2 凋亡效應(yīng) 早前,Karl等[8]研究指出,IRE能通過(guò)下調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá)的比值,造成細(xì)胞器內(nèi)促凋亡因子的釋放,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Beebe等[9]認(rèn)為凋亡可能是繼細(xì)胞膜不可逆性電穿孔數(shù)十分鐘后脈沖對(duì)細(xì)胞的遲發(fā)效應(yīng),通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)凋亡。近來(lái),Tang等[10]觀(guān)察到,陡脈沖作用后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高,細(xì)胞發(fā)生凋亡,并用透射電鏡觀(guān)察到了典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)。

2.3 免疫效應(yīng) 研究表明,免疫功能低下者容易引起惡性腫瘤,同時(shí)腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制因子,從而降低機(jī)體的免疫功能。Miyazakis等[11]認(rèn)為脈沖治療能激發(fā)機(jī)體 T細(xì)胞依賴(lài)性和腫瘤特異性保護(hù)性免疫反應(yīng)。Mi等[12]的一項(xiàng)對(duì)陡脈沖治療后荷瘤鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),陡脈沖電場(chǎng)能增加T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的免疫活性,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的能力,從而導(dǎo)致荷瘤鼠機(jī)體細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)。

2.4 抗血管和淋巴轉(zhuǎn)移效應(yīng) 腫瘤細(xì)胞通過(guò)血管和淋巴轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤預(yù)后的重要因素。Mi等[13]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),陡脈沖可破壞腫瘤營(yíng)養(yǎng)血管和毛細(xì)淋巴管,使其栓塞并凝固性壞死,下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）A和促淋巴管生成因子VEGF-C水平。李均和楊孝軍[14]用美蘭灌注后發(fā)現(xiàn),陡脈沖作用后的癌組織邊緣模糊,無(wú)線(xiàn)樣或環(huán)狀的淋巴管,雙重染色靶區(qū)內(nèi)未見(jiàn)任何呈陽(yáng)性反應(yīng)淋巴管,僅見(jiàn)毛細(xì)淋巴管碎片樣結(jié)構(gòu)。Jarm等[15]發(fā)現(xiàn),即使將電極插入腫瘤周?chē)＝M織亦能抑制腫瘤生長(zhǎng),并證實(shí)是由于脈沖引起腫瘤周?chē)鞴嘧p少所致。

3 IRE治療腫瘤的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

IRE療法治療腫瘤較傳統(tǒng)療法有許多優(yōu)點(diǎn),例如它適于那些不能切除的腫瘤從而保留重要的功能性組織；靠近關(guān)鍵器官（如心臟等）的腫瘤如采用手術(shù)治療或放療均會(huì)導(dǎo)致該器官永久性功能喪失；對(duì)傳統(tǒng)的化療、手術(shù)或放療后均無(wú)效的腫瘤細(xì)胞；它還能減少原位瘤治療后復(fù)發(fā)的可能性等。因此,可以預(yù)見(jiàn)脈沖電場(chǎng)不可逆性電擊穿技術(shù)治療腫瘤這一前沿性的交叉性技術(shù)具有良好的發(fā)展前景。

Miller等[16]將脈沖電場(chǎng)作用于人肝癌細(xì)胞 HepG2,證實(shí)脈沖電場(chǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞確有殺傷作用,發(fā)現(xiàn)IRE是一種不同于射頻消融、高強(qiáng)度聚焦超聲等治療方法的非熱效應(yīng)的物理治療方法,熱效應(yīng)在脈沖電場(chǎng)中的抑瘤作用被排除。M aor等[17]和Maor等[18]將脈沖電場(chǎng)直接作用于鼠左頸總動(dòng)脈,于28d后觀(guān)察發(fā)現(xiàn)血管壁間質(zhì)成分結(jié)構(gòu)完整,沒(méi)有出現(xiàn)動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈破裂、血栓形成等并發(fā)癥,血管內(nèi)皮層有少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞重建,新形成的內(nèi)膜層變薄,這一發(fā)現(xiàn)也有可能為氣囊血管成形術(shù)后冠狀動(dòng)脈再狹窄的治療開(kāi)辟新的途徑。Onik等[19]在超聲介導(dǎo)定位下將脈沖電場(chǎng)作用于小獵犬前列腺,作用區(qū)域鄰近或包括尿道、直腸、血管神經(jīng)束,得到的結(jié)論是鄰近壞死區(qū)域的尿道黏膜、血管神經(jīng)束完整,直腸無(wú)瘺管形成。Al-Sakere等[20]在C57B1/6鼠皮下移植瘤治療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)脈沖電場(chǎng)非選擇性殺滅靶區(qū)內(nèi)包括免疫細(xì)胞的所有細(xì)胞,靶區(qū)外的免疫細(xì)胞由于脈管系統(tǒng)的破壞不能對(duì)腫瘤區(qū)域起到免疫作用,陡脈沖對(duì)正常免疫功能和免疫抑制的腫瘤鼠治療效果是一致的,結(jié)合脈沖電場(chǎng)改善機(jī)體免疫功能的效應(yīng),脈沖電場(chǎng)有望應(yīng)用于治療免疫抑制的腫瘤患者,并取得良好的療效。Neal和Davalos[21]將脈沖電場(chǎng)作用于人乳腺癌M DA-MB-231細(xì)胞,測(cè)得其不可逆性電擊穿的電場(chǎng)閾值基線(xiàn),通過(guò)三維數(shù)字預(yù)測(cè)治療模型的模擬,證明能夠治療較大范圍的不均質(zhì)的靶區(qū),且沒(méi)有明顯的熱效應(yīng),具有成功治療早期乳腺癌的潛在可能性。

Yao等[22]和Mi等[23]用陡脈沖治療儀治療了多種惡性腫瘤手術(shù)離體標(biāo)本,包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌、直腸癌等,治療前后組織學(xué)觀(guān)察顯示對(duì)照組癌細(xì)胞生長(zhǎng)活躍,細(xì)胞密集,間質(zhì)少,核大染色深,而治療組癌細(xì)胞邊界不清,胞質(zhì)融合,核固縮、碎裂,腫瘤血管變性壞死、血栓形成。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),脈沖參數(shù)的選擇及相應(yīng)的電場(chǎng)分布對(duì)組織中是否殘存癌細(xì)胞有重要影響,這說(shuō)明療效與陡脈沖電場(chǎng)的治療參數(shù)有關(guān)。李大強(qiáng)和熊蘭[24]將陡脈沖作用于20例新鮮離體腫瘤組織,腫瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌、直腸癌、橫結(jié)腸癌、膀胱癌。不同類(lèi)型腫瘤分別施以不同參數(shù)后,證實(shí)了陡脈沖治療上述腫瘤的有效性。董曉靜和胡麗娜[25]通過(guò)比較陡脈沖治療前后荷瘤兔的肝腎功能、血常規(guī)、心電圖的變化,證實(shí)了陡脈沖治療的安全性。凌曉娟和熊正愛(ài)[26]、楊曉燕和熊正愛(ài)[27]證實(shí)陡脈沖作用于在體兔肝腫瘤組織壞死后區(qū)面積隨著脈沖參數(shù)的變化而變化,呈明顯的量效關(guān)系,壞死輪廓與電場(chǎng)分布仿真基本吻合,治療后荷瘤兔生存期明顯延長(zhǎng)。綜上所述,目前大量離體或在體的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已進(jìn)一步證實(shí)了IRE的作用機(jī)制及其治療腫瘤的可行性、有效性及安全性,為臨床試驗(yàn)提供了充分的理論依據(jù)。

4 小結(jié)

脈沖電場(chǎng)不可逆性電擊穿的種種獨(dú)特之處展示了其在腫瘤治療中的良好前景,美國(guó)學(xué)者Karl H.Schoenbach教授曾于2004年在《Nature》預(yù)言脈沖電場(chǎng)將在近幾年內(nèi)有望實(shí)現(xiàn)臨床試驗(yàn)并逐步得到應(yīng)用。盡管?chē)?guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)脈沖電場(chǎng)不可逆性電擊穿做了大量的實(shí)驗(yàn)和理論研究工作,但脈沖電場(chǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的不可逆性電擊穿效應(yīng)及其抑制在體腫瘤增殖的規(guī)律和機(jī)制,針對(duì)不同脈沖治療方式的“窗口效應(yīng)”以及最佳治療劑量的合理優(yōu)化、脈沖治療的分子生物學(xué)機(jī)制及其生物醫(yī)學(xué)安全性和有效性評(píng)價(jià)等方面有待得到進(jìn)一步的突破。

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