間充質(zhì)干細胞移植促進炎癥性腸病腸道組織修復(fù)的研究進展

徐艷華,陳曉云綜述,汪維偉審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)干細胞與組織工程實驗室組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 400016）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease,IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD）,有終生復(fù)發(fā)傾向,重癥患者遷延不愈,預(yù)后不良。此病歐美發(fā)達地區(qū)發(fā)病率高,而亞洲國家隨著生活水平的提高,其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。IBD的病因和發(fā)病機制未完全明確,目前的研究認為由多因素相互作用所致,主要包括遺傳、免疫、環(huán)境等因素[1]。由于致病因素不盡相同,發(fā)病的具體環(huán)節(jié)不同,最終導(dǎo)致UC和CD組織損害的表現(xiàn)不同。CD病變可達上消化道,病因與特殊微生物關(guān)系密切,且家族傾向更明顯,使用抗生素有潛在預(yù)防和治療CD的作用,但對UC患者尚無樂觀的報道[2]。現(xiàn)有的IBD治療在于控制活動性炎癥和調(diào)節(jié)免疫紊亂,常用的有3類藥物：水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。長期使用上述藥物又給患者帶來難以克服的不良反應(yīng),且對危重病例的療效有限,無法縮短IBD的自然病程。對病情危重者常須采用外科手術(shù)治療,外科手術(shù)治療后亦存在嚴重影響患者生活質(zhì)量以及術(shù)后復(fù)發(fā)等問題。

用干細胞移植治療IBD,最初多為血液系統(tǒng)惡性疾病合并炎癥性腸病時進行干細胞移植的報道。Ditschkowski等[3]回顧了1994年7月至2002年8月施行的11例血液系統(tǒng)惡性疾病患者異基因外周血造血干細胞移植,這11例中7例合并CD,4例合并UC。移植后經(jīng)34個月隨訪,10例存活,均未表現(xiàn)IBD活動性,只有1例在移植后早期表現(xiàn)輕度持續(xù)性癥狀,提示異基因外周血造血干細胞移植有一定治療作用。2003年Burt等[4]首次以CD為指征進行自體外周血造血干細胞移植，2例嚴重CD患者,腫瘤壞死因子-α等治療無效,克羅恩病活動指數(shù)（Crohn′s disease activity index,CDAI）評分大于250。干細胞通過環(huán)磷酰胺和粒細胞集落刺激因子動員,經(jīng)環(huán)磷酰胺和抗胸腺細胞球蛋白預(yù)處理后回輸。隨訪1年,患者病情緩解（CDAI評分小于100）。Garc í a-Olmo等[5]于2005年用自體脂肪間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stern cells,MSCs）局部注射移植治療4例CD患者并發(fā)的9處瘺管,結(jié)果觀察到6處瘺管的外口在移植后8周末就被新生上皮覆蓋,其余2處瘺管外口存在不完全的閉合,內(nèi)容物外滲減少,在隨訪期間（12～30個月）未觀察到任何不良反應(yīng)。

1 MSCs的生物學(xué)特性

MSCs最早從骨髓中發(fā)現(xiàn),從臍血、胎盤、外周血、肌肉、血管、脂肪、皮膚等組織中也能培養(yǎng)出MSCs,并與骨髓MSCs有相同的多向分化潛能。大量研究證實,在一定誘導(dǎo)條件下MSCs可以向成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞、肌腱細胞及基質(zhì)細胞等中胚層細胞分化,M SCs還可以向外胚層的神經(jīng)元細胞和內(nèi)胚層的肝卵圓細胞分化。已有多項研究表明,把骨髓MSCs植入體內(nèi),可向造血以外的組織如骨、軟骨、肺、皮膚等處定位并分化為相應(yīng)的組織細胞。MSCs表面抗原表型兼有間充質(zhì)、內(nèi)皮和肌肉細胞的特征。其細胞表面標記可分類為：特異性抗原,如SH2、SH3、SH4、STRO-1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SM A）等；細胞因子及生長因子,如白細胞介素類、干細胞因子（SCF）、白細胞抑制因子（LIF）、單核細胞集落刺激因子（M-CSF）等；細胞因子及生長因子受體,如白細胞介素類受體、粒細胞集落刺激因子受體（G-CSFR）、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等；黏附分子,如整合素α ν β3、α ν β5、ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、內(nèi)皮素、CD44等；細胞外基質(zhì),如膠原Ⅰ～Ⅳ型、蛋白聚糖、纖維結(jié)合素、透明質(zhì)酸聚糖。目前MSCs表面標記物研究結(jié)論極不一致,尚無一個理想的表面標記物。

2 MSCs在移植受體腸道的遷移、定植

近年來通過對心、肝、腎、肺、皮膚等組織損傷的研究表明,自體骨髓MSCs有向上述損傷部位遷移并參與相應(yīng)組織修復(fù)的能力[6-7],其定向遷移可能與基質(zhì)細胞衍生因子（SDF-1）、肝細胞生長因子（HGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）、Wnt信號通路等有關(guān)[8-11]。研究表明,MSCs移植入腸道損傷模型受體后能在損傷腸道發(fā)生定植。段進糧等[12]將同種異體雄性大鼠的骨髓MSCs經(jīng)尾靜脈注射于雌性大鼠UC模型體內(nèi),移植后在不同的時間段取結(jié)腸組織做PCR分析。結(jié)果顯示,移植后第7天可在16.7%的大鼠的腸組織中檢測到供體的MSCs；移植后第2l天可在50.0%的大鼠的腸組織中檢測供體的MSCs,表明移植的MSCs可以定植于受體結(jié)腸。這與國外研究結(jié)果一致[13]。

3 MSCs促進IBD腸道修復(fù)可能的機制

3.1 MSCs直接分化為腸黏膜上皮細胞 如前所述,MSCs具有多向分化潛能,在一定誘導(dǎo)條件下,可向成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞等方向分化。MSCs能否分化為腸黏膜上皮細胞,從而直接修復(fù)受損腸道？實驗證明將DAPI標記的第3代胎兒骨髓MSCs種植到腸結(jié)締組織塊表面培養(yǎng)12d時,免疫組化染色結(jié)果顯示在組織塊表面生長的標記細胞有細胞角質(zhì)蛋白（cytokeratin,CK）及CK20的表達[14]。CK是上皮細胞的共同標志之一,CK20則可表達于腸黏膜上皮細胞。這提示骨髓MSCs可以在腸壁結(jié)締組織上生長,并可分化為具有上皮細胞和具有腸上皮表型的細胞。體內(nèi)試驗方面,韓欽等[15]研究發(fā)現(xiàn),在腸道放射性損傷模型中,經(jīng)尾靜脈移植的骨髓MSCs能快速歸巢到損傷的腸道局部,參與腸道上皮細胞的損傷修復(fù)。該實驗組觀察到移植的骨髓MSCs多分布在腸黏膜上皮,且大部分分化為潘氏細胞,還有少量的杯狀細胞分化。移植后2個月,腸黏膜絨毛形態(tài)已基本恢復(fù)正常,提示移植的骨髓MSCs可分化為腸黏膜上皮功能細胞修復(fù)損傷部位。IBD腸道損傷與放射性腸道損傷不盡相同,故骨髓MSCs在體內(nèi)是否也能通過分化為腸黏膜上皮細胞修復(fù)IBD損傷腸道,需要進一步實驗證實。

3.2 參與腸道免疫調(diào)節(jié) IBD的發(fā)病與遺傳、環(huán)境和免疫反應(yīng)異常,特別是腸道局部免疫缺陷有關(guān)。MSCs移植的免疫調(diào)節(jié)作用已在多種疾病的臨床和基礎(chǔ)研究中證實。目前MSCs移植也被成功應(yīng)用于循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)等嚴重自身免疫相關(guān)疾病的治療中[16]。其機制可能為：一方面MSCs可分化為具有功能的細胞以修復(fù)受損組織,另一方面MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用。MSCs可逃避免疫反應(yīng),體外研究發(fā)現(xiàn),未分化的MSCs不能誘導(dǎo)異基因淋巴細胞增殖反應(yīng),提示MSCs為天然且無免疫原性[17-18],當分化為脂肪細胞,成骨細胞和軟骨細胞后仍無免疫原性。即使在CD28刺激性抗體存在作用下，MSCs與人類白細胞抗原不相合淋巴細胞共培養(yǎng)仍不能誘導(dǎo)T細胞增殖[17]。MSCs不能激活T細胞,也不是CD8+細胞毒T細胞的靶目標。動物實驗也表明,異基因MSCs植入具有免疫活性機體后,能在體內(nèi)存活,且在局部微環(huán)境作用下能修復(fù)損傷組織[19]。MSCs有免疫調(diào)節(jié)作用：MSCs能抑制初始和記憶性T細胞,且無主要組織相溶性復(fù)合物限制性,無論MSCs來源于自體或“第三者”都有顯著抑制效應(yīng)。MSCs的免疫抑制作用可能由可溶性因子介導(dǎo),進一步研究表明介導(dǎo)抑制效應(yīng)的可溶性因子可能是肝細胞生長因子（HGF）和轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）,當加入抗HGF和抗TGF-α抗體后,與MSCs共培養(yǎng)T細胞增殖反應(yīng)可獲得恢復(fù)[20]。除作用于T細胞,MSCs還對樹突狀細胞、B細胞、NK細胞等均有免疫調(diào)節(jié)作用[21]。故MSCs移植后定植在腸道,一方面可能分化成或促進功能性腸道細胞的增生、修復(fù)。另一方面可能調(diào)節(jié)腸道異常免疫反應(yīng),發(fā)揮治療IBD的作用。但對此還有待更多、更深入的實驗來證實。

3.3 促進損傷腸道微環(huán)境重建 正常情況下,腸道干細胞的不斷更新和增殖,促進腸道上皮的不斷更新。在腸道受損傷后,腸道干細胞微環(huán)境受到破壞,干細胞不能進行正常的增殖和分化。腸道干細胞微環(huán)境受Wnt、Notch、BMP等多條信號通路的共同調(diào)節(jié)[22]。腸上皮下肌成纖維細胞（intestinal subepithelial myofibroblasts,ISEMFs）位于小腸和大腸的基底膜附近,同時具有成纖維細胞和平滑肌細胞的表型,主要表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SM A）,不表達結(jié)蛋白。據(jù)文獻報道[23],該類細胞通過直接分泌和旁分泌效應(yīng)產(chǎn)生多種細胞因子,參與組成腸道干細胞微環(huán)境。這些細胞因子使之具有廣泛的生物學(xué)功能,如：參與調(diào)控腸道上皮細胞的增殖和分化、黏膜保護、傷口愈合、水和電解質(zhì)的運輸、細胞外基質(zhì)的新陳代謝以及基膜的生長等過程。其中調(diào)控腸道上皮細胞的增殖和分化是通過對信號通路的調(diào)控而實現(xiàn)的。Brittan等[24]觀察到骨髓源性干細胞（bone marrow derived stem cells,BMDSCs）在輻射后腸道發(fā)生定植且可分化為ISEMFs,并且新形成的ISEMFs成簇分布于受體腸隱窩結(jié)構(gòu)附近。但是BMDSCs中含有多種干細胞組分,如造血干細胞、骨髓MSCs等,分化的ISEM Fs是否源于骨髓MSCs需進一步深入探討。因此只能推斷MSCs可能分化為ISEMFs,通過改善受損的干細胞微環(huán)境來間接促進腸上皮修復(fù)、損傷后小腸新生血管的形成,且可促進血液動力學(xué)的恢復(fù),加快腸道干細胞微環(huán)境的重建。已有大量實驗證明,骨髓MSCs在一定條件下可分化為血管內(nèi)皮樣細胞。Mayer等[25]推斷血管內(nèi)皮細胞生長因子可能通過自分泌和旁分泌的途徑誘導(dǎo)骨髓MSCs向血管內(nèi)皮樣細胞分化。Okuyama等[26]認為組織局部微環(huán)境先促使骨髓MSCs表面的血管內(nèi)皮細胞生長因子受體數(shù)量逐漸增加,骨髓MSCs在局部血管內(nèi)皮細胞生長因子的刺激下轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮樣細胞,從而完成組織的血管化進程。

3.4 與腸道細胞發(fā)生融合促進腸道修復(fù) “細胞融合”觀點認為組織內(nèi)原位干細胞和（或）成熟細胞在受到嚴重破壞無法進行重建時,通過細胞核轉(zhuǎn)移可以使成熟細胞重新進入干細胞狀態(tài)[27]。Rizvi等[28]使用 Y-FISH和增強型綠色熒光蛋白免疫組織化學(xué)法雙標記腸上皮細胞,前者作為受體來源細胞標記,后者作為供體來源標記。在所檢測的細胞中,發(fā)現(xiàn)了雙陽性的上皮細胞,證實了移植后供體骨髓來源細胞通過細胞融合機制參與了腸上皮細胞損傷的修復(fù)。如前所述,骨髓來源細胞成分復(fù)雜,除骨髓MSCs外還含有造血干細胞等。所以MSCs是否與成熟的腸上皮細胞或腸道干細胞發(fā)生了融合,尚需進一步研究。

4 MSCs移植治療IBD的應(yīng)用前景

近些年來,MSCs引起了研究者的廣泛關(guān)注。大量基礎(chǔ)研究和臨床試驗已證明MSCs對神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、骨缺損疾病有明顯療效,對肝臟、肺、腎臟、皮膚等器官具有很好的組織修復(fù)作用。MSCs來源于骨髓,也存在于外周血液和其他組織中,易于獲取,體外培養(yǎng)條件不高、細胞分裂增殖快,且由它進行自體移植時不存在組織配型和免疫排斥的問題,所以它在組織工程創(chuàng)傷修復(fù)、基因治療、細胞替代治療等方面均具有很好的臨床應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。臨床上已有MSCs用于治療重度移植物抗宿主?。℅VHD）并發(fā)腸道損傷的報道[29]。在美國已有生物公司完成了對傳統(tǒng)藥物治療無效的CD患者進行健康獻血者骨髓干細胞來源的骨髓基質(zhì)細胞回輸?shù)蘑蚱谂R床試驗。結(jié)果表明治療28d后所有患者的癥狀得到明顯改善。Ⅲ期臨床試驗正在進行中[30]。但是目前為止,還未建立鑒定MSCs的統(tǒng)一標準,MSCs在體內(nèi)的細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)作用機制尚未完全清楚,MSCs廣泛應(yīng)用于臨床還有許多問題有待解決：如MSCs適宜的移植時機、安全的移植路徑、移植細胞的數(shù)量、移植后的細胞能否長期存活及細胞移植后是否具有致瘤性等,這些問題的解決均需要更深入的基礎(chǔ)研究和更多的臨床病例研究及更長時間的隨訪。

總之,MSCs移植治療IBD是一個新方向,其多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)作用、營養(yǎng)作用使MSCs移植有望成為IBD治療的有效途徑。

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