香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌12S rDNA的PCR擴增及序列分析1)

張旭 潘景芝 劉福杰 王琦 李玉

(食藥用菌教育部工程研究中心(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))，長春，130118)(長春市傳染病醫(yī)院)(食藥用菌教育部工程研究中心(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)))

黏菌(Myxomycetes)在生物界中是介于原生動物與真菌之間的一個特殊類群，其名稱、類群范圍及分類地位，在學(xué)者們中的見解始終不一致。雖然現(xiàn)代生物分類學(xué)的發(fā)展日益趨于多界系統(tǒng)，但黏菌仍然是一個存在爭議的類群［1］。黏菌的分布是世界性的，其生境最常見于林中陰涼濕潤的地方。黏菌在原生質(zhì)團時期生活在潮濕的木頭縫隙和樹皮里面，爬行攝食，形成子實體時移到較干燥的基物表面，如腐朽木段、枯枝落葉、樹皮草莖。本研究在其它黏菌分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上［2－7］，將現(xiàn)代分子生物學(xué)方法引入香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌的系統(tǒng)分類，采用CTAB法對基物培養(yǎng)［8－12］獲得的研究標(biāo)本進行DNA提取，用White等［13］設(shè)計的引物對其rDNA片段進行擴增和序列測定分析。探討了香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌的分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系，為其系統(tǒng)演化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌的基物培養(yǎng):將所采基物放于鋪滿濾紙的搪瓷盤中，用無菌水充分濕潤浸透，加塑料布遮蓋，給予一定散射光，在室溫(15～25℃)下培養(yǎng)，觀察黏菌原生質(zhì)團和子實體的發(fā)育過程，至子實體成熟時，收集，陰干后放于標(biāo)本盒中保存，鏡檢鑒定。

總DNA的提取:①CTAB DNA提取液的配制。CTAB 20 g/L，Tris－HCl(pH值8.0)50 mmol/L，Na2EDTA 10 mmol/L，NaCl 0.7 mmol/L。②TE緩沖液的配制。10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA(pH值8.0)。③破壁。取少量孢子(0.1 mg)置于1.5 mL離心管中，加入100 μL CTAB提取液，用玻璃研磨杵研磨。④消化。向離心管中再加入300 μL CTAB提取液，輕輕搖動。將管置于65℃水浴中消化1.0～1.5 h，在此過程中輕輕搖動2～3次。⑤抽提:加入等體積預(yù)冷的氯仿—異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，劇烈振蕩使之形成懸乳狀。12 000 r/min離心10 min，將上清液移至一干凈的離心管中，重復(fù)2次。⑥沉淀。加入3 mol/L NaAc(100～130 μL)使溶液終濃度為0.1 mol/L。加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，上下轉(zhuǎn)動混勻，放入－20℃冰箱過夜，沉淀DNA。⑦洗滌。12 000 r/min離心15 min，棄去上清液，用預(yù)冷的75%乙醇洗滌DNA沉淀，然后棄去冷乙醇。共洗滌2次。管中乙醇倒凈后，將管口傾斜倒置在濾紙上，使乙醇完全揮發(fā)。⑧溶解。加入30 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增:PCR擴增引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，12S上游引物(5'－AAG GAG CCG GTA TCA AGT A－3')，12S下游引物(5'－TAG AGG GAT GTG AAG TGC C－3')［13］。擴增反應(yīng)體系為10倍PCR Buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl25.0 μL，dNTP 5.0 μL，引物各2.0 μL，Taq酶0.6 μL，模板4～6 μL，最后以ddH2O水補足至總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃變性50 s;48～55℃退火50 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次，最后再72℃延伸10 min。在上述PCR的反應(yīng)條件下，將DNA模板原液用TE緩沖液按1∶5，1∶10，1∶15梯度稀釋，改變引物濃度及各項反應(yīng)條件，從而獲取最佳的DNA擴增條件。

PCR擴增產(chǎn)物的檢測:取PCR反應(yīng)產(chǎn)物2.5 μL，在經(jīng)溴化乙錠染色的1%的瓊脂糖凝膠上電泳25 min(200 V)后取出，在FR－200紫外與可見電泳分析裝置上觀察，并照相。

PCR產(chǎn)物的序列測定:將PCR原液送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進行序列測定。

序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:采用Clustal X 1.83對NCBI上已注冊的黏菌12S rDNA基因序列片段進行比對，經(jīng)BioEdit version7.0.9.0人工調(diào)整后，運用分析軟件MEGA4中基于缺失位點百分?jǐn)?shù)的臨位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時進行2000次Bootstrap自舉法檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌子實體及其孢絲、孢子形態(tài)

孢囊群生，有柄，窄圓柱形，頂端稍窄或鈍圓，直立，少數(shù)彎曲，全高3～5 mm，寬0.5～2.0 mm。囊被凋落。柄黑褐色，長為全高的1/3～1/2，囊軸黑色，向上漸細(xì)。孢絲稠密，彎曲，分枝并聯(lián)結(jié)。基質(zhì)層膜質(zhì)，褐色。孢子成堆時淺紫褐色，球形，有小疣，直徑7～9 μm。根據(jù)《中國真菌志——黏菌卷二》［14］鑒定為香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌(圖1)。

圖1 香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌及其孢絲、孢子

2.2 DNA提取

通過CTAB法得到高質(zhì)量的黏菌DNA溶液，可以用于下一步試驗。DNA電泳結(jié)果見圖2。

2.3 PCR擴增

PCR反應(yīng)適宜條件:所用DNA模板濃度以1∶5稀釋擴增效果最好。最佳的反應(yīng)體系為10倍PCR Buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl25.0 μL，dNTP 5.0 μL，引物各2.0 μL，Taq酶0.6 μL，模板4 μL，最后以ddH2O補足至50 μL。

最佳反應(yīng)溫度與時間:94℃變性50 s，在退火溫度為48℃、時間50 s時出現(xiàn)清晰的擴增條帶(圖3)，然后72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。

圖3 香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌PCR擴增結(jié)果

圖2 香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌DNA電泳結(jié)果

2.4 測序結(jié)果

香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌12S rDNA片斷序列見圖4。該序列全長376 bp，GenBank登錄號為HM102318。

圖4 香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌12S rDNA片斷序列

2.5 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌與NCBI上查到的9個黏菌的12S rDNA序列片斷比對結(jié)果見圖5。

粉瘤屬的大粉瘤菌和筒菌屬的筒菌聚在一起，但筒菌的分化早于大粉瘤菌。粉瘤屬的大粉瘤菌，絨泡菌屬的圈絨泡菌、鈣皮菌屬的黑柄鈣皮菌和半網(wǎng)菌屬的棒形半網(wǎng)菌聚集在一起，其Bootstrap支持率為100%，顯示出十分密切的親緣關(guān)系。團網(wǎng)菌屬的灰團網(wǎng)菌與雙皮菌屬的輻射雙皮菌聚在一個分支上。擬發(fā)網(wǎng)菌屬的香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌與煤絨菌屬的煤絨菌及半網(wǎng)菌屬蛇形半網(wǎng)菌聚在一個分支上，其支持率分別為66%和46%。

圖5 基于12S rDNA序列分析得到的NCBI已注冊黏菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

基物培養(yǎng)是黏菌研究的一種必備手段，通過它可以豐富所考察地區(qū)的黏菌分布，彌補野外采集工作的不足。本試驗所采用的濕室培養(yǎng)方法簡便，無需對器皿和試劑進行消毒滅菌，使得以后的培養(yǎng)工作易于進行。從培養(yǎng)條件上看，變溫條件下濕室培養(yǎng)產(chǎn)生黏菌的頻率較高，溫度恒定或過于極端則不利于黏菌子實體的產(chǎn)生，可能是由于變溫的條件更接近于采集地自然的溫度，有利于黏菌子實體的形成。培養(yǎng)中對光照無苛求，只要保證水份濕度，讓其在自然的變溫和散射光條件下就可生長。

在提取黏菌DNA過程中，最重要因素即為細(xì)胞壁破壁過程，適當(dāng)增加研磨時間可以提高提取DNA的質(zhì)量。相對于玻片壓碎法［3］及勻漿器研磨法［15］，應(yīng)用玻璃研磨杵在離心管中直接研磨黏菌孢子［16］，既可以避免勻漿器研磨后轉(zhuǎn)入離心管過程中標(biāo)本的損失，又可以彌補玻片壓碎法中玻片僅能對黏菌孢子破壁的不足，從而可以更好地利用有限的標(biāo)本資源，提取高質(zhì)量黏菌DNA。

線粒體DNA是生物體內(nèi)的核外遺傳信息載體，系共價閉環(huán)的環(huán)狀分子，分子量小，基因組中一般沒有間隔序列，結(jié)構(gòu)簡單，為嚴(yán)格的母系遺傳，幾乎不發(fā)生倒位、易位等畸變與重組，使之容易被檢測。因而線粒體DNA越來越廣泛地被應(yīng)用于各類群的系統(tǒng)進化研究。而12S rDNA基因是線粒體DNA上2個rRNA基因之一，在結(jié)構(gòu)上存在4個結(jié)構(gòu)域，第三結(jié)構(gòu)域是相當(dāng)保守的。該結(jié)構(gòu)域包括32至48號莖，高度保守的側(cè)翼序列使它成為12S rDNA基因中最常被擴增的區(qū)域。同時，12S rDNA基因進化速度較16S、18S、28S rDNA快。因此12S rDNA基因序列適用于研究生物類群的種屬間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系［17］。

目前，GenBank中關(guān)于黏菌12S序列的報道僅有10個種，且關(guān)于香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌分子生物學(xué)方面的研究尚未見報道。本研究首次成功地對香蒲擬發(fā)網(wǎng)菌的12S rDNA片段進行了PCR擴增。該序列的測得為進一步研究黏菌的系統(tǒng)演化提供了依據(jù)。由于部分黏菌的地域性及其培養(yǎng)條件的不成熟在一定程度上限制了黏菌標(biāo)本的來源，進而限制了其分子生物學(xué)方面的發(fā)展，雖然基物培養(yǎng)在一定程度上解決了這個問題，但其培養(yǎng)條件及基物的選擇還有待進一步研究。

與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類不同，在對已知的10個黏菌12S rDNA的序列比對中可以看出團網(wǎng)菌屬、半網(wǎng)菌屬、粉瘤屬、筒菌屬、絨泡菌屬、鈣皮菌屬和雙皮菌屬黏菌的關(guān)系較近，在演化的過程中交替出現(xiàn)。擬發(fā)網(wǎng)菌屬與煤絨菌屬、半網(wǎng)菌屬聚在一個分支上，但是其Bootstrap支持率不高，只能作為參考。黏菌系統(tǒng)發(fā)育的研究需要大量的黏菌基因序列對其分類進行支持，為以后的研究提出了思路。選用不同的分子標(biāo)記也會造成截然不同的結(jié)論，這種現(xiàn)象在分子系統(tǒng)學(xué)研究中并不少見，可能是因不同的DNA標(biāo)記在進化的各階段所起作用不同，或是統(tǒng)計分析方法中存在的某種缺陷所致，仍有待于作進一步研究。在研究某一特定類群的詳細(xì)系統(tǒng)親緣關(guān)系時，單憑某一種或某幾種方法是不夠的，必須綜合多方面資料(形態(tài)、生理、生化、古生物等)進行全面的考查與分析。DNA序列比對結(jié)果做為研究中的證據(jù)之一，還須結(jié)合形態(tài)學(xué)等多種手段，相互印證，才可得出符合客觀規(guī)律的結(jié)論，從而為物種的系統(tǒng)發(fā)育、生態(tài)學(xué)等研究提供重要的信息。

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