白介素4受體I50V、Q576R、P761基因多態(tài)性與塵螨變應(yīng)性鼻炎的關(guān)系探討

黎毓光，劉志偉 ，盧建鵬，李敏雄 ，陳盛強(qiáng)，賴 荷

(1、廣州市番禺區(qū)人民醫(yī)院，廣東 廣州 511400；2、廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510260)

變應(yīng)性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生與許多細(xì)胞因子有關(guān)，以血清中IgE、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)水平顯著升高為特點(diǎn)。發(fā)作時(shí)細(xì)胞因子的產(chǎn)生及炎性介質(zhì)(mediator)的參與均與機(jī)體異常的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，即存在T輔助細(xì)胞亞群功能失調(diào),通過釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)IgE的合成與分泌，并增加炎性細(xì)胞的浸潤和活化。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)可能是變應(yīng)性疾病發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一。IL-4是最強(qiáng)的IgE調(diào)節(jié)因子，其生物學(xué)功能均通過效應(yīng)細(xì)胞表面IL-4受體(IL-4R)介導(dǎo)。鑒于IL-4，IL-4R和IL-4信號傳導(dǎo)過程中的媒介物—轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT6)在IL-4信號傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵地位，及IL-4R基因所在的16號染色體與SIgE存在相關(guān)性，IL-4R基因被列為變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要候選基因。在它們的基因編碼區(qū)段存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，近年來許多國內(nèi)外的研究表明其中某些位點(diǎn)的多態(tài)性與變應(yīng)性疾病相關(guān)。目前國內(nèi)外對IL-4R基因多態(tài)性與塵螨變應(yīng)性鼻炎關(guān)系的研究較少，其結(jié)果也存在較大爭議，而且對不同地區(qū)、不同種族病人的研究結(jié)果亦有較大差別。本研究擬探討IL-4R基因中I50V、Q576R和P761三種基因多態(tài)性在塵螨變應(yīng)性鼻炎組病人中的分布，探討塵螨變應(yīng)性鼻炎發(fā)生的分子遺傳學(xué)機(jī)制及遺傳因素對塵螨變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1研究對象 對照組均為廣東地區(qū)漢族人，飲食結(jié)構(gòu)相似，各研究對象之間無血緣關(guān)系，所有研究對象均除外糖尿病、癌癥、肝腎功能不全、甲狀腺疾病、接受器官移植和嚴(yán)重營養(yǎng)不良等疾病。塵螨變應(yīng)性鼻炎組患者88例，均為廣東漢族人，均是自2007年至2008年在廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和番禺區(qū)人民醫(yī)院就診的患者，其中男54例，女34例，年齡41.7歲(17～70)，均經(jīng)變態(tài)反應(yīng)科或耳鼻喉科按照海口標(biāo)準(zhǔn)診斷為變應(yīng)性鼻炎，且經(jīng)變應(yīng)原檢測為塵螨陽性。對照組：102名，男71名，女31名，均為廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院體檢的廣東地區(qū)漢族人，經(jīng)問診無其他變態(tài)反應(yīng)性疾病，兩組間性別和年齡均無顯著性差異。

1.1 .2 材料 DNA抽提試劑盒(美國Gentra公司)，IL-4R序列來自 GenBank，引物設(shè)計(jì)通過Oligo 6.0軟件完成，I50V位點(diǎn)PCR引物序列如下：上游為5-GGC AGG TGTY GAG GAG CATCC-3，下游為5-GCC TCCGTTGTTCTC AGG TA-3。Q576R位點(diǎn)引物序列：上游為5-GCC CCC ACC AGTGGC TACC-3，下游為5-CCA GTC CAA AGG TGA ACA AGG GG-3。P761位點(diǎn)引物序列：上游為5-AAC AGT GTC ATG GCC AGG AGG ATG-3，下游為5-TCC CACGGA GAC AAA GTTCACG-3。引物由上海生工公司合成，TaqDNA聚合酶和dNTP由北京鼎國生物技術(shù)公司提供。

1.2 方法

1.2 .1制備標(biāo)本基因組DNA，使用苯酚-氯仿法抽提。

1.2 .2 I50V、Q576R、P761位點(diǎn)基因檢測 在滅菌的0.5mL離心管中，按下列順序加樣，建立30μl的反應(yīng)體系：模板 DNA 3.0μl，Primer1 1.0μl，Primer2 1.0 μl，DNTP 3.0 μl，10 ×PCR Buffer 3.0μl，Taq DNA Polymerase 1.0μl，加 H2O 至總體積 30.0μl。 PCR 條件 ：94℃ 預(yù) 變 性 3min，94℃ 變 性 1min，60℃ 退 火1min，72℃延伸 1 min， 循環(huán) 31次；72℃延伸 5min。PCR擴(kuò)增后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為273bp、264bp、281bp。在Eppendorf管中依次加入擴(kuò)增片段10.0μl， Buffer 1.5μl，Rsa I或 Msp I或 Dde I內(nèi)切酶 1.0μl，H2O 2.5μl，混勻后短暫離心，37℃水浴 4h。取酶切后產(chǎn)物10μl進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度12%，以1×TBE作電泳緩沖液，60V電泳5h。電泳完畢，將膠浸在含溴化乙錠終濃度為0.5μg/ml的 1×TBE 中染色 40min，置 300nm 紫外燈下檢測，觀察電泳條帶。

1.3 塵螨變應(yīng)原檢測 取空腹血樣送廣醫(yī)二院變態(tài)反應(yīng)科，在UniCAP 100上測定TIgE含量及塵螨變應(yīng)原。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)算基因的等位基因頻率、基因型頻率、基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性及相對危險(xiǎn)度,組間比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng) PCR擴(kuò)增后，IL-4RαI50V、Q576R和 P761基因目的片段大小分別為273bp、264bp和281bp。

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，10份標(biāo)本，每份重復(fù)5次PCR擴(kuò)增，均產(chǎn)生同樣結(jié)果。

2.3 白介素4受體I50V等位基因的鑒定

標(biāo)本經(jīng)PCR-RFLP后可產(chǎn)生3種酶切格局：IL-4RαI50V正常純合子(VV)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Rsa I消化后產(chǎn)生完全酶切，出現(xiàn)254bp和19bp兩根條帶(19bp帶由于分子量太小而不能在瓊脂糖凝膠中顯示)；IL-4RαI50V 突變純合子型(II)的標(biāo)本，其 PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Rsa I消化后不產(chǎn)生酶切，則電泳后只出現(xiàn)273 bp一根條帶；IL-4RαI50V雜合子型(IV)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Rsa I消化后產(chǎn)生部分酶切，出現(xiàn) 273 bp、254bp和 19bp三根條帶。IL-4RαI50V基因電泳圖譜見圖1。

圖1 IL-4RαI50V等位基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 白介素4受體Q576R等位基因的鑒定

標(biāo)本經(jīng)PCR-RFLP后可產(chǎn)生3種酶切格局：IL-4RαQ576R正常純合子 (QQ)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Msp I消化后產(chǎn)生完全酶切，出現(xiàn)245bp和19bp兩根條帶(19bp帶由于分子量太小而不能在瓊脂糖凝膠中顯示)；IL-4RαQ576R突變純合子型 (RR)的標(biāo)本，其PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Msp I消化后不產(chǎn)生酶切，則電泳后只出現(xiàn)264bp一根條帶；IL-4RαQ576R雜合子型(QR)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Msp I消化后產(chǎn)生部分酶切，出現(xiàn)264bp、245bp和19bp三根條帶。IL-4RαI50V基因電泳圖譜見圖2。

2.5 白介素4受體P761等位基因的鑒定

圖2 IL-4RαQ576R等位基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

標(biāo)本經(jīng)PCR-RFLP后可產(chǎn)生3種酶切格局：IL-4RαP761正常純合子(PP)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dde I消化后，切成49bp、102bp和130bp三個(gè)片段；IL-4RαP761突變純合子型(SS)的標(biāo)本，其PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dde I消化后，切成49bp、50bp、80bp和102bp四個(gè)片段。IL-4RαP761雜合子型(SP)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dde I消化后，切成49bp，50bp，80bp，102bp和130bp五個(gè)片段。由于49bp和50bp的片段相差過小，電泳未能顯示差別。IL-4RαP761基因電泳圖譜見圖3。

圖3 IL-4RαP761等位基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.6 IL-4RαI50V基因型和等位基因頻率在塵螨AR組與對照組中的分布見表1。

運(yùn)用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)性校正等方法分析塵螨AR組與對照組的I50V基因多態(tài)性的分布情況，結(jié)果表明在塵螨AR組與對照組中各基因型頻率均無顯著性差異(P值均大于0.05)，塵螨AR組與對照組之間的等位基因頻率無顯著性差異(χ2=0.87，P=0.34)。

表1 IL-4RαI50V基因型和等位基因頻率在塵螨AR組與對照組中的分布

2.7 IL-4RαQ576R基因型和等位基因頻率在塵螨AR組與對照組中的分布見表2。

表2 IL-4RαQ576R基因型和等位基因頻率在塵螨AR組與對照組中的分布

運(yùn)用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)性校正等方法分析塵螨AR組與對照組的Q576R基因多態(tài)性的分布情況，結(jié)果表明在塵螨AR組與對照組中各基因型頻率均無顯著性差異 (P值均大于0.05)，AR組與對照組之間的等位基因頻率無顯著性差異(χ2=2.34，P=0.13)。

2.8 IL-4RαP761基因型和等位基因頻率在塵螨AR組與對照組中的分布見表3。實(shí)驗(yàn)組中的P等位基因頻率只有4.6%，對照組中的頻率為1.96%。在AR組與對照組的等位基因型與等位基因頻率沒有顯著性差異(P≈1)。

表3 IL-4RαP761基因型和等位基因頻率在塵螨AR組與對照組中的分布

2.9 IL-4RαQ576R、I50V、P761各復(fù)合基因型與變應(yīng)性鼻炎的關(guān)系

由于復(fù)合突變的頻率較低，所以我們把基因的純合突變和雜合突變合并分析。One-way ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，I50V、Q576R、P761的各復(fù)合基因型在AR組和對照組之間的分布差異無顯著性。

3 討論

IL-4Rα基因定位于人類染色體16p12.1，IL-4Rα編碼基因共有11個(gè)外顯子區(qū)，其mRNA有3597bp。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-4受體基因中存在著一系列多態(tài)性。Deichmann K等[1]通過SSCP及直接測序發(fā)現(xiàn)，IL-4Rα基因編碼區(qū)存在著12種常見的多態(tài)性，其中6個(gè)突變位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸順序改變。鑒于IL-4及受體IL-4R在IL-4信號傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵地位，IL-4及IL-4R基因被列為變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要研究對象，在這兩個(gè)基因編碼區(qū)段存在的某些多態(tài)性位點(diǎn)與變應(yīng)性疾病相關(guān)。研究[2]發(fā)現(xiàn)Arg576增強(qiáng)了對IL-4的反應(yīng)性，Arg576能使IL-4R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能增強(qiáng)，合成IgE增加，具有Arg576的個(gè)體更易發(fā)生過敏性疾病。Ryan P等[3]發(fā)現(xiàn)，Arg576不僅與變應(yīng)性疾病有相關(guān)性，而且還與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)性校正等方法分析塵螨AR組與對照組的Q576R基因多態(tài)性的分布情況，結(jié)果表明在塵螨AR組與對照組中各基因型頻率均無顯著性差異(P值均大于0.05)，塵螨AR組與對照組之間的等位基因頻率無顯著性差異。與CuiT等的研究有不同[4]，而與ZhangW等的研究相同[5]。與本研究組之前關(guān)于變應(yīng)性鼻炎的研究結(jié)果存在差異[6]的可能原因是：(1)變應(yīng)性鼻炎病人選擇上的差別，本次研究的對象為塵螨變應(yīng)性鼻炎患者；(2)兩組研究對象的例數(shù)相對較少，有待增加例數(shù)以進(jìn)一步分析、闡明。

Mitsuyasu H[7]等研究發(fā)現(xiàn),I50V多態(tài)性與變應(yīng)性疾病有關(guān)。但Noguchi E等[8]報(bào)道日本人群中I50V等位基因與對照組相比，在哮喘人群中不占優(yōu)勢，IL-4R的I50V的多態(tài)性在基因的遺傳異質(zhì)性上也不起重要的作用。Oiso N等[9]也報(bào)道I50V和特應(yīng)性皮炎沒有相關(guān)性。本研究也表明，AR組與對照組對比，IL-4受體的各基因型頻率均無顯著性差異(P值均大于0.05)。兩組之間等位基因頻率不存在顯著差異。我們的研究結(jié)果表明，IL-4R的I50V的多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎無關(guān)。

Ryan P等[3]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組和對照組中P761的基因頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在本研究中，P761等位基因在人群中較為少見，兩組間的基因型頻率和基因頻率并沒有顯著性的差異。盡管P761在人群中的攜帶率很低，還不能被認(rèn)為是變應(yīng)性鼻炎的可能的易感基因，但P761等位基因有可能和其它的多態(tài)性位點(diǎn)共同作用，它們彼此之間以加性作用或上位性作用的方式影響了基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和調(diào)控，而影響IL-4R的功能，最終使受體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，進(jìn)而增加變應(yīng)性疾病的遺傳危險(xiǎn)性。

在許多病例中，有可能是幾個(gè)基因突變相互作

用去產(chǎn)生一個(gè)高危險(xiǎn)的基因型。這一方面反映出復(fù)合基因突變對疾病影響的復(fù)雜性，另一方面也提示我們在研究基因突變對疾病發(fā)病的影響時(shí)，不應(yīng)局限于單基因的分析，還應(yīng)重視復(fù)合基因型的作用。因此，基因－基因的相互作用有可能是多種疾病的重要影響因素。 基因突變相加作用是否存在于塵螨變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病中，是值得探討的。在本研究中整個(gè)研究樣本，I50V、Q576R、P761突變在本研究對象中均較低，I50V、Q576R、P761復(fù)合突變的頻率也是較低的。因此，本研究把基因的純合突變和雜合突變合并分析，通過 One-way ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，Q576R、I50V、P761的各復(fù)合基因型在塵螨AR組和對照組之間的分布差異無顯著性(P＞0.05)說明從目前調(diào)查的例數(shù)，廣東人群中塵螨性變應(yīng)性鼻炎與I50V、Q576R、P761復(fù)合基因型基因多態(tài)性無關(guān)聯(lián),我們的研究結(jié)果表明與國內(nèi)外結(jié)果不完全一致[10-12]。造成不同人群變應(yīng)性鼻炎組與IL-4Rα有不同的關(guān)聯(lián)的可能原因有很多，例如：(1)變應(yīng)性鼻炎是一種多基因遺傳的疾病，其它基因也可能與變應(yīng)性鼻炎易感性有關(guān)；(2)變應(yīng)性鼻炎病人選擇上的差別；(3)由于各地飲食習(xí)慣、地理環(huán)境、人的生長狀態(tài)等環(huán)境因子改變IL-4Rα的作用效果而使不同地區(qū)的人群IL-4Rα基因多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎相關(guān)性存在著差異。大樣本和單倍體研究將可能有助于闡明IL-4Rα基因多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎的關(guān)系。

[1]Deichmann K,Bardutzky J,Forster J,et al.Common polymorphisms in the coding part of the IL-4 receptor gene[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,231(3):696-697.

[2]Rosenwasser LJ,Klemm DJ,DresbackJK,et al.Promoter polymorphisms in the chromosome 5 gene cluster in asthma and atopy[J].Clin Exp Allergy,1995,25(Suppl2):74-78.

[3]Ryan P,Andrew S,Burrell L,et al.Analysis of the Ser786Pro Interleukin-4 ReceptorαAllelic Variant in allergic and nonallergic asthma and its functional consequences[J].Clinical Immunology,2001,100(3):298-304.

[4]Cui T,Wu J,Pan S.Polymorphisms in the IL-4 and IL-4R[alpha]genes and allergic asthma[J].Clin Chem Lab Med.2003,41(7):888-92.

[5]Zhang W,Zhang X,Qiu D.IL-4 receptor genetic polymorphisms and asthma in Asian populations[J].Respir Med.2007,101(1):186-90.

[6]黎毓光,盧建鵬,李敏雄,等.白介素4受體基因Q576R多態(tài)性及與變應(yīng)性鼻炎的相關(guān)性[J].解剖學(xué)研究,2008,30(4):261-263.

[7]Mitsuyasu H,Izuhara K,Mao XQ,et al.Ile50Val variant of IL-4R alpha upregulates IgE synthesis and associateswith atopic asthma[J].Nat Genet,1998,19(3):119-120.

[8]Noguchi E,Shibasaki M,Arinami T,et al.No association between atopy/asthma and the Ile50Val polymorphism of IL-4 receptor[J].Am JRespir Crit Care Med,1999,160(1):342-345.

[9]Oiso N,Fukai K,IshiiM.Interleukin-4 receptor alpha chain polymorphism Gln551Arg is associated with adult atopic dermatitis in Japan[J].Br JDermatol,2000,142(5):1003-1006.

[10]Huang CZ,Yang J,Qiao HL,et al.Polymorphisms and haplotype analysis of IL-4Ralpha Q576R and I75V in patients with penicillin allergy[J].Eur JClin Pharmacol,2009,65(9):895-902.

[11]Melén E,Umerkajeff S,Nyberg F.Interaction between variants in the interleukin-4 receptor alpha and interleukin-9 receptor genes in childhood wheezing:evidence from a birth cohort study[J].Clin Exp Allergy,2006,36(11):1391-1398.

[12]Franjkovic I,Gessner A,Konig I.Effects of common atopy-associated amino acid substitutions in the IL-4 receptor alpha chain on IL-4 induced phenotypes[J].Immunogenetics,2005,56(11):808-17.