異丙酚對(duì)胚胎大鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響

張立平

(溧水縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 211200)

目前異丙酚的腦保護(hù)研究主要以神經(jīng)元為對(duì)象，有關(guān)異丙酚對(duì)胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響報(bào)道較少。異丙酚是臨床十分常用的麻醉鎮(zhèn)靜藥[1，2]，有研究顯示異丙酚具有一定的腦保護(hù)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究異丙酚干預(yù)胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞后缺氧復(fù)氧損傷神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、乳酸脫氫酶、脂質(zhì)過(guò)氧化的影響,進(jìn)一步說(shuō)明異丙酚對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，為異丙酚在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 14d胚胎大鼠，體重為250～300g(江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 主要試劑和儀器 小牛血清(杭州四季青生物公司)；DMEM培養(yǎng)基為(美國(guó)Sigma公司)；異丙酚由暨南大學(xué)生物工程研究所提供(純度＞95%)；MTT(武漢博士德生物工程有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CO2培養(yǎng)箱為(Forma Scientific，USA)；ELx800 酶標(biāo)儀 (美國(guó) BIO-TEK公司)。IX70-S8F/SIF-141倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本)；GNL-B3氧量分析儀(上海昶艾電子科技有限公)； 95%N2-5%CO2混合氣平衡過(guò)的單向氣流缺氧裝置(蘇州安創(chuàng)儀器有限公司)。

1.3 胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞的制備 用脫頸椎法處死妊娠14 d孕鼠，在無(wú)菌條件下分離出胎鼠中腦，浸入37℃的胎牛血清。 Hanks平衡液(1:1v/v)5～10min，用Hanks液漂洗3次后，用0.25%胰蛋白酶消化10min，加入小牛血清終止消化后經(jīng)200目鋼絲網(wǎng)篩過(guò)濾，離心洗去胰蛋白酶。加入DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含50U/ml的青霉素，50μg/ml的鏈霉素和15%小牛血清)制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率，采用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。結(jié)果活細(xì)胞率為90%，再用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至3×105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)24h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷模型的建立 取培養(yǎng)24小時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞，用15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng),(預(yù)先充入95%N2-5%CO2混合氣和30min)，而后迅速將培養(yǎng)細(xì)胞移入同種95%N2-5%CO2混合氣平衡過(guò)的單向氣流缺氧裝置,測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)排氣口氧濃度(＜1%)，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中缺氧6h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)及生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞分組 正常對(duì)照組、缺氧損傷模型組、異丙酚干預(yù)組(濃度分別為10、25、50、100μmol/L)。 1.5MTT 法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞存活率 以4×105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板的神經(jīng)細(xì)胞，缺氧損傷模型組及異丙酚干預(yù)組缺氧處理24h，正常對(duì)照組37℃、5%CO2培養(yǎng)箱同步孵育，每孔加入 MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，振蕩 10min，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng) 490nm處測(cè)吸光度值。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.6 細(xì)胞外LDH活性的測(cè)定 接種于24孔板的神經(jīng)元，缺氧損傷模型組及異丙酚干預(yù)組缺氧處理24h，正常對(duì)照組37℃、5%CO2培養(yǎng)箱同步孵育，取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液200μl，用比色法測(cè)定LDH的活力,具體檢測(cè)過(guò)程及操作方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 細(xì)胞內(nèi)SOD活性、MDA和GSH含量測(cè)定 接種于24孔板的神經(jīng)元,各實(shí)驗(yàn)組處理同上，0.25%胰酶消化，血清中止，離心1000r/min，10min，去上清后，每孔加入0.1mol/L TBA-0.05mmol/L EDTA(pH=8.0)1ml，再加入 50μl 1%Triton-X100，將培養(yǎng)板置于震蕩器上震蕩 1min使細(xì)胞溶解，加入100μl 25%HPO3以沉淀蛋白，10000r/min 4℃離心。用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，用改良二硫雙硝基苯甲酸定量法測(cè)定GSH活性，按硫代巴比妥酸(Thibabituric acid，TBA)比色法測(cè)定MDA含量。用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD活性；用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量，具體檢測(cè)過(guò)程及操作方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，對(duì)均值進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

圖1 正常對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖2 缺氧組細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖3 異丙酚(40～80μg/L)和缺氧組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖4 異丙酚(100μg/L)和缺氧組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.1 異丙酚對(duì)大鼠胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)觀察 由見(jiàn)圖1～圖4，用倒置顯微鏡下觀察活細(xì)胞生長(zhǎng)情況,對(duì)照組細(xì)胞形成團(tuán)簇，突起增長(zhǎng)，并借突起彼此連接形成網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞呈梭形或椎形，核大而圓，有折光性，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞界限清楚。缺氧24h的模型組可見(jiàn)各組神經(jīng)細(xì)胞突起變少或消失，細(xì)胞團(tuán)松散，表現(xiàn)為缺氧損傷狀態(tài)。缺氧后加異丙酚組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，異丙酚對(duì)胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用。缺氧24h后細(xì)胞集落及細(xì)胞數(shù)有明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，異丙酚(40、80、100μg/L)對(duì)缺氧胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞逐漸增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 MTT檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞存活率 由表1可見(jiàn)，MTT測(cè)定結(jié)果，缺氧模型組與正常對(duì)照組比較，OD值均有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；異丙酚劑量(20～100μg/L)干預(yù)缺氧24h后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生存率OD值較模型組均有所增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，P＜0.01)。

表1 異丙酚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)生存率的影響s，n=5)

表1 異丙酚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)生存率的影響s，n=5)

注：與正常對(duì)照組相比(*P＜0.05；**P＜0.01)；與缺氧模型組和異丙酚干預(yù)組相比，**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L) OD值(24h)正常對(duì)照組缺氧模型組異丙酚干預(yù)組--1 0 20 40 80 100 0.659±0.032 0.4280.053**0.460±0.032 0.491±0.045*0.562±0.024**0.684±0.052**0.596±0.064**

2.3 異丙酚對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活力的影響 由表2可見(jiàn)。神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，上清液中的LDH活力增高，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；異丙酚組可以顯著降低細(xì)胞中LDH活力，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 異丙酚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活力的影響(±s，n=5)

表2 異丙酚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活力的影響(±s，n=5)

注： 與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L) LDH(U/L)正常對(duì)照組缺氧模型組異丙酚干預(yù)組--1 0 20 40 80 100 78.52±16.26 241.52±14.21**132.32±16.35 134.24±15.84*148.72±13.34**162.34±17.62**151.54±15.64**

2.4 異丙酚對(duì)缺氧損傷神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)SOD活性、MDA及GSH含量的影響

表3 異丙酚對(duì)缺氧損傷神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性、MDA和GSH 含量的影響±s，n=5)

表3 異丙酚對(duì)缺氧損傷神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性、MDA和GSH 含量的影響±s，n=5)

注： 與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L)SOD(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)GSH(mg/g ptor)正常對(duì)照組缺氧模型異丙酚干預(yù)組--1 0 20 40 80 100 87.36±18.35 30.69±11.32**62.54±9.47 60.42±7.42**50.72±5.62**48.35±6.34**42.36±4.33**7.592±0.54 10.52±1.36*4.36±1.25 6.624±1.82*5.941±0.76*6.375±0.92*6.824±0.84*72.72±9.72 92.65±10.53 71.38±9.72 69.37±8.74*52.32±7.54*49.52±6.33*42.64±6.47*

由表3可見(jiàn)。缺氧組與正常對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，MDA、GSH含量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而異丙酚 40～100μg/L 處理組，與缺氧模型組比較均可減少細(xì)胞內(nèi)SOD活性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，MDA和GSH含量的產(chǎn)生，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

氧化損傷是引起缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，在大鼠心臟缺血再灌注過(guò)程中，異丙酚輸注能減少M(fèi)DA含量和提高SOD活性，并呈劑量依賴性，丙二醛(MDA)是氧化損傷過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物；超氧化物岐化酶(SOD)能清除氧自由基，其活性反映了機(jī)體抗氧化損傷的能力[4]，與組織損傷的程度密切相關(guān)。異丙酚是一種抗炎劑通常用于全身麻醉、鎮(zhèn)靜在加護(hù)病房的病人[5]。臨床上尚未見(jiàn)不良反應(yīng)，但仍然存在一些不足之處。藥物給藥途徑與劑型方面有待改進(jìn)，使藥物定位準(zhǔn)確具有選擇性的治療作用，從而使受損部位能達(dá)到有效濃度，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞因缺血缺氧受到損傷時(shí)，線粒體功能異常，氧化呼吸鏈?zhǔn)軗p，電子傳遞阻斷，ATP產(chǎn)生減少。琥珀酸脫氫酶是琥珀酸氧化呼吸鏈里重要的復(fù)合酶之一，所以，琥珀酸脫氫酶的活性，可以反映神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)表明，缺氧損傷模型組比正常對(duì)照組吸光度值顯著性降低，結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的活性已經(jīng)降低，細(xì)胞呼吸功能受損，說(shuō)明缺氧24h可以損害神經(jīng)細(xì)胞代謝能力。乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定來(lái)評(píng)估和量化細(xì)胞死亡[6]，與缺氧損傷模型組比較，異丙酚各劑量組可以顯著提高細(xì)胞活性，說(shuō)明異丙酚能對(duì)抗缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞琥珀酸脫氫酶活性的損害，維持缺氧損傷細(xì)胞的呼吸功能。乳酸脫氫酶是參與細(xì)胞能量代謝的一個(gè)重要的酶。同時(shí)產(chǎn)生ATP。缺氧導(dǎo)致細(xì)胞急性損傷時(shí)，細(xì)胞膜完整性遭到破壞，胞通透性增加，LDH將從胞漿中釋放出來(lái)，在離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中可以引起細(xì)胞活力的下降，活細(xì)胞數(shù)目的減少，乳酸脫氫酶(LDH)的釋放增加因此LDH是反映胞膜完整性的重要檢測(cè)指標(biāo)[7]。與缺氧損傷模型組比較，異丙酚各劑量組均可顯著減少缺氧條件神經(jīng)元細(xì)胞LDH的外漏量，一定程度上保持了神經(jīng)元膜的完整性。在神經(jīng)元缺血缺氧的同時(shí)，活性氧爆發(fā)性產(chǎn)生，而組織中清除氧自由基的SOD活性卻降低了，導(dǎo)致氧自由基堆積,使膜脂質(zhì)過(guò)氧化而致細(xì)胞損傷當(dāng)體內(nèi)有過(guò)量的氧自由基時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物，在導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力受損[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧24h的模型組可見(jiàn)各組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞集落及細(xì)胞數(shù)有明顯下降，突起變少，表現(xiàn)為缺氧損傷狀態(tài)。異丙酚可以增強(qiáng)了強(qiáng)抗氧化酶心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。且隨異丙酚的劑量增高其抑制效應(yīng)加強(qiáng)。缺氧后加異丙酚組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常當(dāng)異丙酚劑量在25、50、100μg/L范圍內(nèi)對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞逐漸增多作用。說(shuō)明異丙酚對(duì)胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用。

綜上所述，異丙酚可顯著減少缺氧條件神經(jīng)元LDH的外漏量，一定程度上保持了神經(jīng)元膜的完整性。另也通過(guò)增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞清除自由基的能力，對(duì)抗缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞膜氧化損傷，對(duì)缺氧損傷神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。并通過(guò)內(nèi)在抗氧化機(jī)制恢復(fù)和增強(qiáng)了抗氧化酶活性，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)引起的細(xì)胞內(nèi)損傷。

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