軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)犬真皮成纖維細胞向軟骨細胞表型分化的實驗研究

趙貴慶 崔磊 曹誼林

軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)犬真皮成纖維細胞向軟骨細胞表型分化的實驗研究

趙貴慶 崔磊 曹誼林

目的探討軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1（Cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP1）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的犬真皮成纖維細胞（Dermal fibroblasts，DFs）向軟骨細胞表型分化的可行性。方法應(yīng)用CDMP1細胞誘導(dǎo)液對體外擴增至第4代的犬DFs進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察細胞的形態(tài)變化，以免疫熒光染色和RT-PCR檢測細胞中軟骨特異蛋白的表達情況。結(jié)果誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后，實驗組部分DFs呈星形或多角形，免疫組化染色顯示有軟骨特異的II型膠原分泌，RT-PCR檢測也表明有Ⅱ型膠原、aggrecan和SOX9表達。但是誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，均轉(zhuǎn)為陰性。結(jié)論CDMP1可以誘導(dǎo)犬DFs向軟骨細胞表型分化，有可能成為組織工程化纖維軟骨的種子細胞。

真皮成纖維細胞纖維軟骨細胞軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1組織工程

纖維軟骨主要分布于半月板、顳下頜關(guān)節(jié)盤、椎間盤等關(guān)節(jié)內(nèi)，細胞外基質(zhì)中含有大量的Ⅰ型膠原和少量的Ⅱ型膠原以及粘多糖。由于纖維軟骨中沒有血運，再生能力差，所以纖維軟骨的損傷往往引起重要的功能障礙，如顳下頜關(guān)節(jié)盤損傷引起的顳下頜關(guān)節(jié)功能紊亂等，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。組織工程的發(fā)展為纖維軟骨的修復(fù)提供了新的途徑。

真皮成纖維細胞（Dermal fibroblasts，DFs）是真皮組織中合成細胞外基質(zhì)的主要細胞，也是人體中分布最為廣泛、數(shù)量最多、最易于獲取和體外培養(yǎng)的細胞。我們的早期研究發(fā)現(xiàn)，軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1（Cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP1）可以誘導(dǎo)人DFs向軟骨細胞表型分化[1－3]。本研究將深入探索DFs作為纖維軟骨種子細胞的可能性。

1 對象與方法

1.1 細胞來源

犬皮膚成纖維細胞來自成年健康Beagle犬（購自上海農(nóng)學(xué)院）腹部皮膚真皮組織。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 主要試劑及來源

CDMP1（PeproTech公司，美國），DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基（Gibco，美國），胎牛血清（FBS）（Hyclone，美國），綿羊血清（BSA）（上海華美生物工程公司），RT－PCR引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），vimentin多克隆抗體（Santa Cruz公司），F(xiàn)ibronectin單克隆抗體（Aachen公司，德國），鼠抗人CollagenⅠ（Cambridge公司，英國），鼠抗人CollagenⅡAb3（Neomarkers公司，美國），AMV逆轉(zhuǎn)錄酶XL（大連寶生物工程有限公司）。

1.2.2 主要儀器及型號

CO2培養(yǎng)箱（Forma公司，美國），無菌超凈工作臺（上海博訊實驗有限公司），恒溫搖床（太倉華美生化儀器廠），普通臺式離心機（TDL-40B，上海安亭醫(yī)療儀器廠），光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），精密電子天平（Sartorius公司，德國），60 mm、100 mm培養(yǎng)皿和50 mL離心管（Falcon公司，美國），0.22 μm針孔過濾器（Millipore公司，美國）。

1.3CDMP1誘導(dǎo)培養(yǎng)DFs及DFs分化檢測

1.3.1 細胞獲取

無菌條件下切取犬下腹部皮膚2 cm×2 cm，分離、提純DFs，體外擴增培養(yǎng)至第4代，備用。

1.3.2 細胞鑒定

應(yīng)用兔抗人vimentin多抗克隆抗體和鼠抗人Fibronectin單克隆抗體對體外擴增培養(yǎng)第4代的犬DFs進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察確定分離細胞的類型。

1.3.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)

取第4代近融合的DFs，按4×105個/皿的細胞密度接種于100 mm培養(yǎng)皿，實驗組加入7 mL含100 ng/mL的CDMP1、含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液（軟骨誘導(dǎo)液），對照組中加入等量含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液（基礎(chǔ)培養(yǎng)液），37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每3天換液1次，觀察細胞形態(tài)的變化。

1.3.4 免疫熒光染色

分別消化收集單層CDMP1誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d的DFs，制備細胞爬片，進行Ⅰ型和Ⅱ型膠原的免疫熒光染色。以原代培養(yǎng)的透明軟骨細胞作為Ⅱ型膠原的陽性對照和Ⅰ型膠原的陰性對照，以原代培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細胞為Ⅰ型膠原的陽性對照。檢測細胞分泌軟骨主要細胞外基質(zhì)的能力。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

以從新鮮犬半月板中提取的RNA為陽性對照，成軟骨誘導(dǎo)6 d的DFs為實驗組，未誘導(dǎo)的DFs為對照組，檢測Ⅰ型膠原Ⅰα1，Ⅱ型膠原Ⅱα1以及aggrecan和SOX9基因的表達，以GAPDH為內(nèi)參照，引物序列如表1所示。

表1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）中應(yīng)用的引物Table 1Nucleotide primers used for RT－PCR

2 結(jié)果

2.1Vimentin和Fibronectin免疫熒光染色

擴增至第4代的真皮成纖維細胞形態(tài)均一，表現(xiàn)出典型的長梭形，細胞突起較長，互相連接，細胞在培養(yǎng)皿中黏附良好，具有較強的活力。第4代真皮成纖維細胞Vimentin和Fibronectin免疫熒光染色陽性，在胞質(zhì)中具有較強表達（圖1），證明自犬皮膚中獲取的成纖維細胞具有間充質(zhì)來源特性。

2.2CDMP-1誘導(dǎo)單層培養(yǎng)的DFs向軟骨細胞分化

第4代的DFs接種后以含有100 ng/mL的CDMP1誘導(dǎo)培養(yǎng)，以不含有CDMP1的為對照組。1 d后實驗組（圖2A）和對照組（圖2D）無明顯差異，細胞均為長梭形；6 d后，實驗組（圖2B）和對照組（圖2E）有明顯的不同，對照組仍是成纖維細胞典型的長梭形，而實驗組中有一部分細胞呈橢圓形或星形，其余細胞呈長梭形；在培養(yǎng)10 d后，實驗組和對照組細胞均呈長梭形，指紋狀排列，兩組間沒有差異。

2.3 細胞免疫熒光染色

Ⅱ型膠原是軟骨細胞特異的細胞外基質(zhì)，真皮組織中不含有Ⅱ型膠原。CDMP1誘導(dǎo)6 d后，Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示，部分細胞呈陽性；非誘導(dǎo)組細胞未見有陽性結(jié)果。Ⅰ型膠原在誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組中均呈強陽性表達，即DFs在表達Ⅱ型膠原的同時，保留了Ⅰ型膠原的表達（圖3）。

2.4RT-PCR

CDMP1誘導(dǎo)的DFs單層培養(yǎng)6 d后，RT-PCR檢測表明，誘導(dǎo)組和陽性對照組中Col 2和SOX9表達陽性，而對照組中未見有表達；aggrecan在實驗組和對照組中均有表達，但是實驗組和陽性對照組的條帶亮度明顯較對照組強；而ColⅠα1在各組中均為高表達，無明顯差異（圖4）。

圖1 第4代犬DFs（400×）Fig.1The 4thpassage of DFs(400×)

圖2 CDMP1誘導(dǎo)單層培養(yǎng)的DFs（400×）Fig.2The morphology of canine DFs treated with CDMP1(400×)

圖3 6d后，Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原免疫熒光染色檢測（熒光顯微鏡，400×）Fig.3After 6 days,confirmed by ColⅠandⅡimmunofluorescent staining(Fluorescence microscope,400×)

圖4 RT－PCR檢測Fig.4RT-PCR detection

3 討論

CDMPs是BMP家族的成員，CDMP1又稱為BMP14、GDF5，是與軟骨形態(tài)發(fā)生和發(fā)育相關(guān)的最為特異的一類生長因子，CDMP1在出生后可繼續(xù)維持其生物學(xué)特性，并促進軟骨組織的損傷修復(fù)過程[4]。CDMP1主要通過調(diào)節(jié)間充質(zhì)前體細胞的分化，參與軟骨組織發(fā)生、發(fā)育與損傷修復(fù)的全部的生物學(xué)過程，是調(diào)節(jié)軟骨細胞分化的重要生長因子[5]。研究發(fā)現(xiàn)，CDMP1可以誘導(dǎo)三維培養(yǎng)的骨髓來源間充質(zhì)細胞向軟骨細胞表型分化[6]；CMDP1可以在體外誘導(dǎo)韌帶來源的成纖維細胞向軟骨細胞的表型分化，并且沒有堿性磷酸酶活性的上調(diào)[7]。我們的早期研究發(fā)現(xiàn)，CDMP1可以誘導(dǎo)體外單層培養(yǎng)的人真皮成纖維細胞表達軟骨特異的Ⅱ型膠原和aggrecan[5]。

真皮成纖維細胞是分化完全的終末體細胞，通常認為其不再具備如干細胞那樣向其他類型細胞分化的能力。但是，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，真皮中含有一些具有干細胞特性的亞細胞類型，在一定的條件下可以向軟骨細胞、骨細胞和脂肪細胞表分化[8]。我們的早期研究證明，DFs可以在體外構(gòu)建組織工程肌腱和角膜[9]。DFs獲取簡單，可在短時間內(nèi)擴增至所需的細胞數(shù)量，傳代過程中不會去分化。所以，真皮中的成纖維細胞可能是一個潛在的組織工程化種子細胞庫。已有文獻報道多種方法可以誘導(dǎo)DFs向軟骨細胞系分化，如SOX5、6和9因子聯(lián)合轉(zhuǎn)染[10]、在aggrecan或perlecan涂層的二維表面上培養(yǎng)[11]以及與脫鈣骨粉的共培養(yǎng)[12]等。

本研究以成年Beagle犬為研究對象，分離培養(yǎng)皮膚中的成纖維細胞，在單層培養(yǎng)條件下，細胞具有成纖維細胞典型的長梭形特征。體外傳代至第4代后，細胞形態(tài)均一，具有較強的增殖能力；免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，細胞中Vimentin和Fibronectin呈陽性表達，這說明我們分離培養(yǎng)的細胞具有間充質(zhì)來源細胞的特性。

我們應(yīng)用含有100 ng/mL CDMP1的誘導(dǎo)液培養(yǎng)單層條件下的DFs，發(fā)現(xiàn)6 d后誘導(dǎo)組細胞形態(tài)與非誘導(dǎo)組有明顯的區(qū)別，非誘導(dǎo)組中細胞呈典型的成纖維細胞狀外觀，而誘導(dǎo)組中一部分細胞呈橢圓形或多角形，類似于原代培養(yǎng)的透明軟骨細胞。在第10天時，由于細胞增殖，培養(yǎng)皿中細胞密度增大，誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組細胞均表現(xiàn)為成纖維細胞樣長梭形特征，兩組之間沒有差別。對體外誘導(dǎo)培養(yǎng)第6天的細胞進行細胞爬片，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組中部分細胞Ⅱ型膠原染色陽性，而對照組中未見有陽性細胞。Ⅰ型膠原染色發(fā)現(xiàn)，不論誘導(dǎo)組還是非誘導(dǎo)組都表現(xiàn)為強陽性。誘導(dǎo)培養(yǎng)第10天時，兩組中Ⅱ型膠原染色均為陰性，Ⅰ型膠原染色均為陽性。對體外誘導(dǎo)第6天和第10天的細胞進行RT-PCR檢測，也進一步證實了上述結(jié)果。值得注意的是，RTPCR顯示，在培養(yǎng)第6天時，誘導(dǎo)組中SOX9和aggrecan表達陽性，而在非誘導(dǎo)組中僅有aggrecan的微量表達。SOX9是軟骨細胞的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，它是屬于HMG box（High mobility group）家族中的SRY（Sex determining region Y）亞家族。有研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過程中，SOX9與Ⅱ型膠原的表達具有平行關(guān)系[2]。這說明，CDMP1可以在單層培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)犬DFs表達軟骨特異的Ⅱ型膠原和aggrecan，使DFs向軟骨細胞表型分化，但是誘導(dǎo)10 d后，細胞的外形又恢復(fù)為長梭形結(jié)構(gòu)，Ⅰ型膠原免疫熒光染色陰性，且Ⅱ型膠原及SOX9的表達均轉(zhuǎn)陰?？梢姡珻DMP1不能在單層培養(yǎng)條件下維持DFs分化的軟骨細胞表型。我們早期的研究發(fā)現(xiàn)，CDMP1誘導(dǎo)微團培養(yǎng)的人DFs在2周后有大量細胞表現(xiàn)出軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，細胞外基質(zhì)中有大量的黏多糖沉積[5]，提示三維環(huán)境可能更有利于細胞表型的維持。

總之，本研究表明，犬皮膚成纖維細胞在體外單層培養(yǎng)條件下具有較強的增殖能力，能夠滿足組織工程對種子細胞增殖能力的要求；CDMP1可以誘導(dǎo)單層培養(yǎng)的犬DFs向軟骨細胞分化，但是不能長期維持這種分化狀態(tài)。在后續(xù)的研究中，我們將對CDMP1誘導(dǎo)三維培養(yǎng)的DFs向軟骨細胞分化的能力進行更為深入地研究。

[1]崔磊,尹爍,鄧辰亮,等.軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)真皮成纖維細胞向軟骨細胞表型分化的影響因素[J].中華醫(yī)學(xué)雜志.2005;85 (33):2331-37.

[2]尹爍,崔磊,李綱,等.CDMP1誘導(dǎo)成纖維細胞向成軟骨細胞表型分化的實驗研究[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2004;24(6):254-57. [3]崔磊,尹爍,鄧辰亮.軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)真皮成纖維細胞表達軟骨細胞表型的實驗研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志.2004;84(15): 1304-1309.

[4]Mizunoand S,Glowadcki J.Chondroinduction of human dermal fibroblasts by demineralized bone in three-dimensional culture [J].Exp Cell Res,1996,227(1):89-97.

[5]Peretti GM,Gill TJ,Xu JW,et al.Cell-Based therapy for meniscal repair:a Large animal study[J].Am J Sports Med,200432(1):146-158.

[6]Yates KE,Mizuno S,Glowacki J.Early shifts in gene expression during chondroinduction of human dermal fibroblasts[J].Exp Cell Res,2001;265(2),203-211.

[7]Yoo JU,Barthel TS,Nishimura K,et al.The chondrogenic potential 63(7):755-760.

[3]Murray JC.Keloids and hypertrophic scars[J].Clin Dermatol,1994, 12(1):27-37.

[4]Tredget EE,Nedelec B,Scott PG,et al.Hypertrophic scars,keloids, and contractures:the cellular and molecular basis for therapy[J]. Surg Clin North Am,1997,77(3):701-730.

[5]Cone RD,Lu D,Koppula S,et al.The melanocortin receptors: agonists,antagonists,and the hormonal control pigmentation[J]. Recent Prog Horm Res,1996,51:287-317.

[6]Koonin AJ.The aetiology of keloids:a review of the literature and a new hypothesis.S Afr Med J,1964,38:913-916.

[7]鄭健生,邢新,張敬德.α-促黑素細胞激素及其對成纖維細胞的生物學(xué)作用[J].中國臨床康復(fù),2002,6(22):3414-3415.

[8]肖調(diào)立,龍劍虹,黃曉元.α-促黑素細胞激素和白細胞介素8在病理性瘢痕組織中的表達及意義[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007,119(36):7215-7218.

[9]Kiss M,Wlaschek M,Brenneisen P,et al.Alpha-melanocyte stimulating hormone induces collagenase/matrix metalloproteinase-1 in human dermal fibroblasts[J].Biol Chem Hoppe Seyler,1995, 376(7):425-430.

[10]Bohm M,Raghunath M,Sunderkotter C,et al.Collagen metabolism is a novel target of the neuropeptide alpha-melanocyte-stimulating hormone[J].J Biol Chem,2004,279(8):6959-6966.

[11]Bohm M,Luger TA.Melanocortins in fibroblast biology--current update and future perspective for dermatology[J].Exp Dermatol, 2004,13(4):16-21.

[12]Butler PD,Longaker MT,Yang GP.Current progress in keloid research and treatment[J].J Am Coll Surg,2008,206(4):731-741.of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells[J]. J Bone Joint Surg Am,1998;80(12):1745-1757.

[8]Hoben GM,Koay EJ,Athanasiou KA.Fibrochondrogenesis in two embryonic stem cell lines:effects of differentiation timelines[J]. Stem Cells,2008,26(2):422-430.

[9]Vanderploeg EJ,Imler SM,Brodkin KR,et al.Oscillatory tension differentially modulates matrix metabolism and cytoskeletal organization in chondrocytes and fibrochondrocytes[J].J Biomech, 2004;37(12):1941-1952.

[10]Izuta Y,Ochi M,Adachi N,et al.Meniscal repair using bone marrow derived mesenchymal stem cells experimental study using green fluorescent protein transgenic rats[J].Knee,2005,12(3):217-223.

[11]Chang HY,Chi J-T,Dudoit S,et al.Diversity,topographic differentiation,and positional memory in human fibroblasts[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(20):12877-12882.

[12]Ikeda T,Kamekura S,Mabuchi A,et al.The combination of SOX5, SOX6,and SOX9(the SOX trio)provides signals sufficient for induction of permanent cartilage[J].Arthritis Rheum,2004,50(11): 3561-3573.

（收稿日期：2011年4月3日，修回日期：2011年4月27日）

Study of CDMP1 Inducing DFs into Chondrogenic Lineage in Vitro

ObjectiveTo explore the feasibility of cartilage-derived morphogenetic protein-1(CDMP1)inducing dermal fibroblasts(DFs)into chondrogenic lineage.MethodsThe fourth passage of DFs isolated from canine were induced by CDMP1.The morphological changes were observed and the expression of cartilage specific proteins were detected by immunofluorescent staining and RT-PCR.ResultsAfter inducing 6 days,stellar-like or polygonal-like cells were observed, and cartilage specific collagen typeⅡwas detected by immunofluorescent staining as well as RT-PCR examination.Other cartilage specific proteins as aggrecan and SOX9 were detected by RT-PCR.But these effects could not be maintained after inducing 6 days.ConclusionCDMP1 could induce DFs into chondrogenic lineage,and CDMP1 induced DFs is promising to be the seed cell of engineered fibrochondrocytes.

Dermal fibroblasts;Fibrochondrocytes;Cartilage-derived morphogenetic protein-1;Tissue engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）03－0139－05

ZHAO Guiqing1,CUI Lei2,CAO Yilin2.
1 Yahan Medical Aesthetic Hospital,Changsha 410007,China.2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai 200011,China.

2011年3月12日，

2011年5月4日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.005

410000湖南省長沙市長沙亞韓醫(yī)學(xué)美容醫(yī)院（趙貴慶）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點實驗室（崔磊，曹誼林）。