兔陰囊原位構(gòu)建組織工程化睪丸假體的實(shí)驗(yàn)研究

吳玉家 朱鴷 周廣東 江華

兔陰囊原位構(gòu)建組織工程化睪丸假體的實(shí)驗(yàn)研究

吳玉家 朱鴷 周廣東 江華

目的探討以HDPE-PGA復(fù)合支架接種兔耳軟骨細(xì)胞后,于兔陰囊原位內(nèi)構(gòu)建組織工程化睪丸假體的可能性。方法取成年兔耳軟骨分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，制備HDPE-PGA復(fù)合支架，細(xì)胞-支架復(fù)合物體外培養(yǎng)2w。摘除單側(cè)兔睪丸后即時(shí)將經(jīng)體外培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合物植入陰囊原位，術(shù)后3m將兔處死取材。單純支架植入為對(duì)照組。標(biāo)本行大體觀察、組織學(xué)、組織化學(xué)、免疫組化、GAG含量檢測(cè)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組取材標(biāo)本經(jīng)檢測(cè)具有預(yù)制形態(tài)與體積，有新生軟骨組織產(chǎn)生，軟骨組織呈島狀分布，其間有不同程度的纖維組織長入及炎性細(xì)胞浸潤。對(duì)照組無軟骨形成。結(jié)論兔陰囊原位內(nèi)構(gòu)建組織工程化睪丸假體具有預(yù)制形態(tài)與體積、結(jié)構(gòu)與組織學(xué)形態(tài)良好。

組織工程化軟骨高密度聚乙烯兔睪丸假體

臨床上,各種原因所致睪丸缺失的患者往往需要植入睪丸假體，目前常用的睪丸假體存在一定的組織相容性問題[1-3]。為從根本上解決這一問題，構(gòu)建組織工程化睪丸假體日漸成為研究熱點(diǎn)。在前期研究中，我們以醫(yī)用多孔高密度聚乙烯（HDPE）為內(nèi)支撐在裸鼠體內(nèi)成功構(gòu)建出具有睪丸形態(tài)的HDPE-軟骨復(fù)合體[4]。但裸鼠為免疫缺陷動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還須進(jìn)一步在具有免疫活性的動(dòng)物體內(nèi)加以驗(yàn)證。在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)并制備了兔睪丸原位植入模型，旨在探討原位構(gòu)建組織工程化睪丸假體的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM、胎牛血清（FCS）、PGA購自Gibco公司，HDPE購自Porex Surgical公司，氯胺酮、速眠新購自上海南匯區(qū)宣治化工廠。健康成年兔10只，雄性，2.0～2.4 Kg，上海寶山區(qū)寶牧實(shí)驗(yàn)兔養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及懸液制備

實(shí)驗(yàn)兔麻醉后（每2.5 Kg肌注氯胺酮0.4 mL、速眠新0.8 mL），切取單耳置入75%乙醇內(nèi)浸泡消毒30 min，無菌條件下去除皮膚、軟骨膜及纖維板，將軟骨剪成大小相對(duì)一致的顆粒（2 mm×2 mm），0.25%氯霉素浸泡20 min、磷酸鹽酸緩沖液（PBS）沖洗，加入0.25%胰蛋白酶，于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化30 min，吸棄液體，PBS沖洗2次，加入0.1%Ⅱ型膠原酶，于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化3 h，吸棄液體，加入0.05%Ⅱ型膠原酶（含5%FBS的DMEM配制）繼續(xù)消化12～14 h,直至軟骨塊基本消失。常規(guī)收集、接種、培養(yǎng)細(xì)胞并傳代，收集第1代細(xì)胞并以含10% FBS的DMEM配成密度為5×107cells/mL的細(xì)胞懸液，備用。

1.2.2 支架的制備與預(yù)處理

將HDPE雕刻成長、短徑分別為6 mm和4 mm的橢圓體，外裹2 mm厚PGA，作為睪丸假體支架（圖1）。支架在細(xì)胞接種前先置于75%乙醇中浸泡消毒30 min，PBS沖洗2遍，吸干，備用。

1.2.3 細(xì)胞—支架復(fù)合及培養(yǎng)

將軟骨細(xì)胞懸液均勻滴加于支架表面，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，移入盛有10%FBS的DMEM的離心管（50 mL）內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2周，隔天換液。

圖1 HDPE—PGA復(fù)合支架Fig.1HDPE—PGA scaffold

圖2 大體外觀Fig.2Gross view

1.2.4 兔陰囊原位細(xì)胞—支架復(fù)合物植入

實(shí)驗(yàn)兔全麻后，四肢外展仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。術(shù)區(qū)2%硫化鈉溶液脫毛備皮，常規(guī)消毒。于單側(cè)睪丸一側(cè)縱形切開皮膚至提睪肌，分離肌肉，見睪丸及附睪等組織，于睪丸兩端縫扎后摘除睪丸組織，植入體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞—支架復(fù)合物，提睪肌減張劈開，皮膚切口直接拉攏，0號(hào)絲線間斷全層縫合（圖2）。實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后肌注抗菌素?cái)?shù)日，常規(guī)飼養(yǎng)，于術(shù)后3個(gè)月取材。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組

A組（n=5）：細(xì)胞—支架復(fù)合物植入；B組（n=5）：?jiǎn)渭冎Ъ苤踩搿?/p>

1.2.6 觀察指標(biāo)

取材標(biāo)本行大體觀察、HE染色、組織化學(xué)（Safranin O染色，Masson trichrome染色）及Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè)，Alcian Blue法檢測(cè)構(gòu)建組織中糖胺聚糖（GAG）含量。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察和組織學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)兔均成活良好，術(shù)后未出現(xiàn)傷口感染或植入體外露等。取材時(shí)，陰囊外形正常，表面有毛發(fā)生長，皮膚紅潤，觸之質(zhì)較韌。

A組移植物外緊密包裹薄層富含血管網(wǎng)的纖維膜樣組織，去凈包膜后見睪丸假體的形狀、體積與植入初期未發(fā)生明顯變化，外觀呈淡黃色，具有一定的彈性。橫切面示新生軟骨與中央部的HDPE接合緊密，外層軟骨厚度均勻，約1.5～2.0 mm（圖3）。HE染色顯示標(biāo)本外層構(gòu)建的組織均存在相對(duì)明顯的3層：外層與內(nèi)層為纖維組織，其間有炎性細(xì)胞浸潤并有新生血管存在，中間為軟骨組織，表現(xiàn)為大量的軟骨細(xì)胞及成熟的軟骨陷窩，PGA降解較完全；軟骨組織呈島狀分布，其間有不同程度的纖維組織長入及炎性細(xì)胞浸潤。B組無軟骨組織形成，為纖維組織。

圖3 睪丸假體剖面外觀Fig.3Sectional view of retrieved implants

2.2 組織化學(xué)檢測(cè)

A組Safranin O染色、Masson trichrome染色示軟骨組織形成部位均呈陽性，表明細(xì)胞外有大量GAG及膠原成分合成，細(xì)胞基質(zhì)合成和分泌功能旺盛。B組上述染色均呈陰性。

2.3 Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè)

A組Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果顯示，構(gòu)建的軟骨組織中有被染成棕黃色的Ⅱ型膠原，在軟骨細(xì)胞周圍尤為明顯（圖4）。B組呈陰性結(jié)果。

圖4A組3個(gè)月后取材組織學(xué)及免疫組化染色Fig.4Histology and immunohistochemistry staining of the speciem after 3 months of group A

2.4GAG含量檢測(cè)

A組取材標(biāo)本GAG含量為4.44±0.48 mg/g。B組未檢測(cè)到GAG含量。

3 討論

先天性隱睪、睪丸扭轉(zhuǎn)、睪丸損傷、睪丸腫瘤、附睪睪丸炎以及兩性畸形等疾患均可引起睪丸缺失，常導(dǎo)致局部外形缺陷以及患者的心理障礙。目前，臨床上治療睪丸缺失的方法首選為睪丸假體的植入。睪丸假體材料最新的為鹽水充注型硅膠假體[5]。但是凝膠充注型硅膠假體存在凝膠滲漏現(xiàn)象，另有炎癥、感染及外露等問題，此類假體體內(nèi)植入的長期安全性及生物相容性尚未得以確認(rèn)[1-3]。

2000年，Baez等[6]于裸鼠陰囊內(nèi)成功構(gòu)建了具有睪丸形態(tài)的組織工程化軟骨。但是要構(gòu)建臨床適用大小（長、短徑約為16 mm和12 mm）[7]的睪丸假體，必須要解決組織工程化軟骨構(gòu)建中的“空心”現(xiàn)象。前期研究中，我們以HDPE為內(nèi)支撐成功解決了這一難題[8]，并在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建出具有預(yù)構(gòu)睪丸形態(tài)且組織學(xué)良好的HDPE—軟骨復(fù)合體[4]。本實(shí)驗(yàn)將體外擴(kuò)增的兔軟骨細(xì)胞接種于HDPE—PGA復(fù)合支架，經(jīng)體外培養(yǎng)2周后，于兔陰囊原位植入3個(gè)月，形成了預(yù)制睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)與組織學(xué)形態(tài)良好的纖維軟骨—HDPE復(fù)合體（睪丸假體）。

PGA在免疫活性動(dòng)物體內(nèi)引起的炎性會(huì)導(dǎo)致構(gòu)建的軟骨質(zhì)量降低[9－10]，本實(shí)驗(yàn)通過延長軟骨細(xì)胞—PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)時(shí)間（2周）來解決這一問題，因?yàn)檠娱L體外培養(yǎng)時(shí)間后，PGA大部分降解并被更多的細(xì)胞外基質(zhì)所包裹，減少了體內(nèi)植入后由PGA降解產(chǎn)物引起的炎性反應(yīng)；另外，支架孔隙內(nèi)被過多的細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)所充填，不利于體內(nèi)植入后新生血管及纖維組織的長入[11]。

后續(xù)的研究中，我們認(rèn)為種子細(xì)胞來源可考慮選取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，以避免取耳軟骨傷害動(dòng)物[12]。另外，針對(duì)雙側(cè)睪丸缺失的患者，研發(fā)具有睪丸酮可控釋放系統(tǒng)的組織工程化睪丸尤為必要[13]，這些都將在今后的研究中進(jìn)行深入的探索，以期為研發(fā)更為理想的適用于臨床的睪丸假體提供了可能。

[1]Doherty AP,Mannion EM,Moss J,et al.Spread of silicone to inguinal lymph nodes from a leaking testicular prosthesis:a cause for chronic fatigue[J]?BJU Int,2000,86(9):1090.

[2]John TT,Fordham MV.Spontaneous rupture of testicular prosthesis with external leakage of silicone-a rare event[J].J Urol,2003,170 (4 Pt 1):1306.

[3]Lappe MA.Silicone-reactive disorder:a new autoimmune disease caused by immunostimulation and superantigens[J].Med Hypotheses, 1993,41(4):348-352.

[4]吳玉家,江華,周廣東,等.構(gòu)建帶內(nèi)支撐組織工程睪丸假體的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2007,21(11):1243-1246.

[5]Bodiwala D,Summerton DJ,Terry TR.Testicular prostheses: development and modern usage[J].Ann R Coll Surg Engl,2007, 89(4):349-353.

[6]Baze CE,Yoo JJ,Kim B,et al.Creation of tissue engineered testicular prosthesis[J].J Urol,2000,163(Suppl):303.

[7]中國解剖學(xué)會(huì)體質(zhì)調(diào)查委員會(huì).中國人解剖學(xué)數(shù)值[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002,206.

[8]Wu Y,Zhu L,Jiang H,et al.Engineering cartilage substitute with a specific size and shape using porous high-density polyethylene (HDPE)as internal support[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2010, 63(4):e370-375.

[9]Santavirta S,Konttinen YT,Saito T,et al.Immuneresponse to polyglycolic acid implants[J].J Bone Joint Sur Br,1990,72(4): 597-600.

[10]Aigner J,Tegeler J,Hutzler P,et al.Cartilage tissue engineering with novel nonwoven structured biomaterial based on hyaluronic acid benzyl ester[J].J Biomed Mater Res,1998,42(2):172-181.

[11]Kamil SH,Kojima K,Vacanti MP,et al.In vitro tissue engineering to generate a human-sized auricle and nasal tip[J].Laryngoscope, 2003,113(1):90-94.

[12]Zhu L,Wu Y,Jiang H,et al.Engineered cartilage with internal porous high-density polyethylene support from bone marrow stromal cells:a preliminary study in nude mice[J].Br J Oral Maxillofac Surg,2010,48(6):462-465.

[13]Raya-Rivera AM,Baez C,Atala A,et al.Tissue engineered testicular prostheses with prolonged testosterone release[J].World J Urol, 2008,26(4):351-358.

Experimental Study on Construction of Tissue-Engineered Testicular Prosthesis in Situ on Rabbit

ObjectiveTo investigate the feasibility on construction of tissue-engineered testicular prosthesis in situ by incorporating rabbit chondrocytes with porous high density polyethylene-polyglycolic acids(HDPE-PGA)scaffold.Methods Chondrocytes obtained from rabbit ear cartilage were seeded onto HDPE-PGA scaffold.After culturing 14 days in vitro,the cell-scaffold construct was implanted into scrotum immediately after the removal of testis and the scaffold was also implanted as control.The rabbits were sacrificed after 3 months.Gross observation,microscopy，histology and immunohistochemistry were done,and GAG content was detected.ResultsThe newly formed complex was similar to testicle in gross view and showed island distribution of the cartilage,ingrowth of fibrous tissue and infiltration of inflammatory cells.ConclusionThe tissue-engineered testicular prosthesis in situ within the scrotal of rabbit have good shape,structure and histological manifestation.

Tissue-engineered cartilage;HDPE;Rabbit;Testicular prosthesis

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）03－0136－03

WU Yujia1,3,ZHU Lie1,ZHOU Guangdong2,JIANG Hua1.
1 Department of Plastic Surgery,Changzheng Hospital,The Second Military Medical University,Shanghai 200041,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;3 Center of Burning,Plastic,Reconstructive and Aesthetic Surgery,General Hospital of The People′s Liberation Army General Staff Department(The 309thHospital of Chinese People′s Liberation Army),Beijing 100094,China.Corresponding author: JIANG Hua(Email：dosjh@126.com)

2011年4月2日，

2011年4月27日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.004

200041上海市第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院整形外科（吳玉家，朱鴷，江華）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（周廣東）；100094北京市解放軍總參謀部總醫(yī)院（309醫(yī)院）整形美容燒傷修復(fù)中心（吳玉家）。

，江華（Email：dosjh@126.com）。