人腹膜中間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性的初步研究

吳黎敏 林慶凡 李航 李黎洪 張勁帆

人腹膜中間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性的初步研究

吳黎敏 林慶凡 李航 李黎洪 張勁帆

目的探討人腹膜中是否含有間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSC），并研究其生物學(xué)特性。方法腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的胃癌患者。將腹膜剪碎，Ⅰ型膠原酶消化后以低密度接種，2周后計算細胞群中成纖維細胞集落形成單位（Colony-forming unit-fibroblast，CUF-F）數(shù)量；流式細胞分析貼壁細胞表型；定向誘導(dǎo)2周后，堿性磷酸酶和油紅O染色，觀察細胞體外成骨和成脂肪能力。結(jié)果貼壁的細胞呈成纖維細胞樣，消化的腹膜細胞群中，CFU-F比例平均為0.574‰（0.26‰～0.84‰）。流式分析顯示，細胞均一表達CD29、CD44和CD73，不表達CD31、CD34和CD45。成骨細胞定向誘導(dǎo)后，細胞呈現(xiàn)堿性磷酸酶活性；成脂誘導(dǎo)后細胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，油紅O染色陽性。結(jié)論人腹膜中富含MSC，可作為一個含有生物支架的干細胞來源。

間充質(zhì)干細胞腹膜成纖維細胞集落形成單位

腹膜是一種源自中胚層的組織，富含血管，且有一定韌性。常規(guī)的體外培養(yǎng)方法構(gòu)建的組織工程化組織，缺乏血管結(jié)構(gòu)，細胞缺乏氧供和營養(yǎng)物質(zhì)，是影響構(gòu)建組織體內(nèi)功能的關(guān)鍵因素。因此，腹膜因富含血管，已成為常用的生物材料，用于氣管、膀胱和腸組織的構(gòu)建[1-3]。此外，腹膜也可能是干細胞的來源。腹膜中的脂肪組織應(yīng)含有間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）[4]，而血管外膜是MSC體內(nèi)的存在部位。因此，我們推測，腹膜可能富含MSC，可作為含有自體干細胞的天然支架材料。為此，我們將手術(shù)切除的腹膜消化后進行培養(yǎng)，并對貼壁細胞的特性進行了初步研究，證實了腹膜可作為MSC的來源之一。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Ⅰ型膠原酶（Invitrogen公司）。胎牛血清（北京元亨匯眾生物技術(shù)公司）。人MSC專用血清（Stem Cell公司）。單克隆抗體（BD公司）。分化誘導(dǎo)劑，包括地塞米松、磷酸甘油、消炎痛、抗壞血酸磷酸鹽及IBMX等，均為培養(yǎng)純試劑（Sigma公司）。BCIP/NBT染色液（北京中杉生物技術(shù)公司）。細胞流式儀（FACScalibur，BD公司）。細胞篩（BD公司）。

1.2 材料

腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的胃癌患者，共5例，均為男性，年齡49～64歲。手術(shù)過程中發(fā)現(xiàn)腹膜黏連，進行了大網(wǎng)膜部分切除術(shù)。

1.3 細胞的消化和接種

將腹膜剪至1 mm3左右的碎片，加入5倍體積的0.1%膠原酶Ⅰ型，37℃消化2 h。加入等體積的胎牛血清。用細胞篩（孔直徑70 μm）過濾去除組織殘渣，800 r/min室溫離心6 min。計活細胞數(shù)，并將細胞懸浮于含10%胎牛血清的α-MEM中。血清為經(jīng)篩選的人MSC專用。將消化所得細胞分為2份，其一按5×103cells/cm2接種于培養(yǎng)皿中，用于培養(yǎng)成纖維細胞-集落形成單位（Colony-forming unit-fibroblast，CFU-F）；另一份按照1×106cells/cm2接種于培養(yǎng)瓶中，用于培養(yǎng)MSC。

1.4CFU-F計數(shù)

培養(yǎng)2周后去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次。加入0.1%甲醛室溫固定10 min。PBS洗滌后加入瑞氏染液，室溫反應(yīng)15～30 min。PBS洗滌2次，計直徑大于5 mm的集落數(shù)。

1.5 細胞傳代

培養(yǎng)1周時，貼壁細胞密度達到80%左右。吸除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，加入0.05%胰蛋白酶，室溫消化3 min。此時，少量細胞懸浮于消化液中，大部分細胞仍呈梭形并貼壁。加入胎牛血清中和后，離心收集細胞，并計活細胞數(shù)。細胞按6×103cells/cm2密度接種傳代。

1.6 流式細胞儀檢測

收集第3代細胞，PBS洗滌后分管，每管細胞數(shù)為5×105個。分別加入PE標記的小鼠抗人CD29、CD44、CD73、CD31、CD34和CD45單克隆抗體，室溫避光反應(yīng)30 min。PBS洗滌后，F(xiàn)ACSCalibur收集數(shù)據(jù)，WinMdi 29軟件進行分析。

1.7 成骨細胞分化誘導(dǎo)

收集第3代細胞，按照6×103cells/cm2接種，當(dāng)細胞密度達到60%時，加入含有抗壞血酸磷酸鹽（50 μM）、磷酸甘油鈉鹽（10 mM）、地塞米松（100 nM）和10%FCS的α-MEM中，每3～4天換液1次。第14天去除培養(yǎng)基，PBS洗滌后，加入BCIP/NBT染色液，室溫反應(yīng)10 min，以顯示細胞內(nèi)堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的活性。

1.8 脂肪細胞誘導(dǎo)及鑒定

細胞傳代培養(yǎng)達80%密度時，加入含地塞米松（1 μM）、IBMX（0.5 mM）、消炎痛（100 μM）和10% FCS的α-MEM。第3天換液1次，第8天進行油紅O染色。即，細胞用4%多聚甲醛室溫固定1 h，70%乙醇沖洗。用新鮮配制的染色液染色1～2 h，70%乙醇洗去過多染料，用蒸餾水清洗，鏡下觀察并攝像。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)

腹膜組織消化后培養(yǎng)1周，部分細胞貼壁生長，形態(tài)呈梭形；繼續(xù)培養(yǎng)至第10天時，細胞致密，呈草束狀分布（圖1）。

圖1 腹膜細胞形態(tài)學(xué)特征（光鏡，100×）Fig.1The morphological features of peritoneum cells (Light microscope,100×)

2.2CFU-F含量

將消化的細胞低密度培養(yǎng)，2周后形成大量的CFU-F，比例達0.574‰（0.26‰～0.84‰）。

2.3 表型分析

流式細胞分析表明，與人骨髓和脂肪源MSC相似，腹膜消化后培養(yǎng)的貼壁細胞均一表達CD29、CD44和CD73，而不表達CD31、CD34和CD45，符合人MSC鑒定標準[5]（圖2）。

圖2 貼壁細胞的表型特征Fig.2Phenotype features of the adherent cells

2.4 分化功能分析

為進一步進行驗證，在貼壁細胞培養(yǎng)體系中加入成骨和成脂肪誘導(dǎo)劑，2周和7 d后分別進行堿性磷酸酶和油紅染色，大多數(shù)細胞呈現(xiàn)強堿性磷酸酶活性；而成脂體系誘導(dǎo)后，細胞分化為成熟的脂肪細胞（圖3）。

圖3 細胞分化特性分析（光鏡，200×）。。Fig.3Analysis on the differentiation features (Light microscope,200×)

3 討論

MSC是一群具有成骨、成脂肪和成軟骨能力的干細胞，有研究表明，MSC甚至可以跨胚層向神經(jīng)細胞和肝臟細胞等分化[6]。更有趣的是，MSC具有低免疫原性和很強的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，異體骨髓MSC已經(jīng)進入Ⅲ期臨床試驗，用于移植物抗宿主病和克隆氏病的治療。此外，MSC已經(jīng)得到美國FDA批準，作為一個孤兒藥，用于Ⅰ型糖尿病的治療。

目前，人們已從多種組織中成功分離MSC，包括骨實質(zhì)[7]、胰腺[8]、血管和脂肪[9]等；甚至，外周血中也可能存在MSC[10]。然而，關(guān)于腹膜中是否存在MSC，相關(guān)報告較少。我們的實驗證明，將腹膜消化后進行接種，部分細胞貼壁生長，而且這種貼壁細胞具有以下特點：①成纖維細胞樣；②表達間充質(zhì)細胞標記物CD73，而不表達造血細胞標記物（CD34和CD45）及內(nèi)皮細胞標記物（CD31）；③具有體外成骨和成脂肪能力。因此，這群細胞基本符合公認的MSC鑒定標準[5]。更為重要的是，腹膜消化的細胞中，CFU-F比例超過萬分之一，遠高于人骨髓單個核細胞中的CFU-F含量（1/100 000）[11]。因此，人腹膜中富含MSC，可作為特殊患者MSC細胞治療的一個來源；或者，腹膜可作為一種特殊的含有干細胞的生物材料，用于組織工程化組織的構(gòu)建。

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The Biological Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Peritoneum

ObjectiveTo observe the existence of mesenchymal stem cells(MSCs)in the human peritoneum and investigate their biological characteristics.MethodsThe peritoneum was harvested from five patients with gastric cancer. The peritoneum was cut into pieces and digested by collagenase typeⅠ.The harvested cells were seeded at a low density and the number of colony-forming unit-fibroblast was counted after culturing 14 days.The phenotypic features of the adherent cells were analyzed by flow cytometric techniques.Their osteogenesis and adipogenesis in vitro were evaluated by alkaline phosphatase and Oil Red O staining after 2 weeks of directional induction.ResultsThe adherent cells were fibroblast-like in morphology,and the proportion of CFU-F in the digested cells was 0.574‰(0.26‰-0.84‰).The expressions of CD29,CD44 and CD73 were positive while the expressions of CD31,CD34 and CD45 were negative.The cells were positive for alkaline phosphatase after osteogenic induction.Meanwhile,intracellular lipid droplets appeared after adipogenic induction and was shown positive by Oil-Red O staining.ConclusionMSCs are rich in human peritoneum and they might be served as a source for stem cells with natural scaffolds.

Mesenchymal stem cells;Peritoneum;Colony-forming unit-fibroblast

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）03－0133－03

WU Limin,LIN Qingfan,LI Hang,LI Lihong,ZHANG Jinfan.
Department of Oncology,Putian College affiliated Hospital,The Affiliated Teaching Hospital of Fujian Medical University,Putian 351100,China.Corresponding author:WU Limin(E-mail：ptxywlm@126.com).

2011年4月26日，

2011年5月11日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.003

351100福建省莆田市福建醫(yī)科大學(xué)莆田學(xué)院附屬醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院腫瘤科。

吳黎敏（E-mail：ptxywlm@126.com）。