人表皮細胞抽提物重編程脂肪干細胞的實驗研究

唐新杰 謝峰 宋楠 張群

人表皮細胞抽提物重編程脂肪干細胞的實驗研究

唐新杰 謝峰 宋楠 張群

目的觀察人表皮細胞抽提物重編程人脂肪干細胞（hADSCs），使其向表皮細胞轉化。方法超聲乳化人表皮細胞，離心后獲得抽提液凍存?zhèn)溆?。培養(yǎng)2～3代hADSCs，鏈球菌溶血素O（SLO）處理后加入表皮細胞抽提液。7 d時觀察hADSCs形態(tài)學、角蛋白K1/10及K19基因的變化及細胞膜K1/10及K19蛋白表達的變化。結果SLO處理hADSCs后，可使hADSCs的通透率明顯增加，達70%左右。加入表皮細胞抽提液后的hADSCs變?yōu)楸砥ぜ毎赜械匿伮肥瘶有螒B(tài)，并表達表皮細胞特有的K1/10及K19基因及膜蛋白。結論表皮細胞抽提液可以重編程hADSCs，使其向表皮細胞轉化。

脂肪干細胞表皮細胞抽提液重編程

細胞抽提物重編程是近年來逐漸發(fā)展起來的獲取目的細胞的方式，通過提取目的細胞的細胞質和細胞核中的可溶性成分，作用于相應的受體細胞，使其轉變?yōu)槟康募毎幕虮硇汀⑿螒B(tài)，并具有相應的功能[1-4]。這一策略為病損組織器官替代修復提供了新思路。在大面積皮膚缺損患者的治療中，往往面臨著自體皮膚供體不足的問題，如果可以通過細胞抽提物重編程方式將體內大量存在的脂肪干細胞（ADSCs）轉變?yōu)楸砥ぜ毎瑒t能為缺損組織提供充足的皮膚種子細胞，從而促進創(chuàng)傷的修復。本研究將人表皮細胞的抽提物引入到hADSCs中，觀察表皮細胞抽提物能否對后者進行重編程，誘導其向表皮細胞分化，并進行相應的鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；表皮細胞培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；鏈球菌溶血素（Streptolysin O，SLO；Sigma公司，美國）；細胞乳化超聲破碎儀（上海比朗儀器有限公司，中國）；PCR試劑盒（Invitrogen公司，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)

1.2.1 脂肪干細胞的分離和培養(yǎng)

無菌條件下行脂肪抽吸術后，收集腹部脂肪（1例30歲女性患者），用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3～4次，以除去紅細胞和細胞碎片。清洗后加入等體積0.075%的Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫搖床消化60 min后，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液和漂浮的脂肪細胞，獲得高密度的細胞沉淀物。用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸后，以1×106的細胞密度接種于10 cm培養(yǎng)皿內。本實驗所用hADSCs為培養(yǎng)的第2～3代細胞。

1.2.2 表皮細胞的分離和培養(yǎng)

臨床術后廢棄皮膚組織以PBS沖洗，加入0.25% DispaseⅡ于4℃過夜。次日分離表皮和真皮，剪碎表皮后，加入適量0.25%胰酶，37℃消化30 min。消化結束后加入適量含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液以終止胰酶的作用。過濾后離心收集細胞，得到的細胞用表皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至90%融合時收集細胞，液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩４_到所需數(shù)量后解凍，重新接種后收集細胞。

1.3 表皮細胞抽提物的制備

收集到的表皮細胞用PBS清洗2次后離心，棄上清后加入預冷的細胞裂解液（Sigma公司，美國）。細胞懸液用脈沖超聲勻漿化，直至光鏡下觀察不到細胞結構及胞核結構。4℃下以15 000 r/min離心15 min，提取上清蛋白質溶液，分裝于凍存管中，迅速于液氮中冷凍1 min，放入-80℃冰箱中備用。

1.4 抽提物加入鏈球菌溶血素O（Streptolysin O, SLO）滲透處理后的hADSCs

收集2～3代的hADSCs，于冰冷的PBS中洗滌2次后，分裝于1.5 mL的EP管中，4℃下1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入終濃度為230 ng/mL的SLO溶液。每100 μL SLO溶液中平均為1×105個細胞。將細胞置于37℃水浴中50 min，每隔15 min重懸1次。50 min后，離心收集細胞。每1×105個細胞加入100 μL抽提液和ATP生成體系（1 mM ATP，10 mM磷酸肌酸，25 μg/mL肌酸激酶及ATP、CTP、GTP、UTP各1 mmol/L；Sigma公司，美國）。此細胞混懸液在37℃水浴箱中孵育1 h，每20 min重懸1次。此過程中，抽提液中成分進入hADSCs內。孵育結束后，加入10%FBS的DMEM（含有2 mM的CaCl2），放置于37℃水浴中2 h，以封閉胞膜孔道。離心后更換成表皮培養(yǎng)液，細胞種植于培養(yǎng)皿。24 h后換液并去除未貼壁細胞，以后每3天換液1次。滲透化處理后的脂肪干細胞設立實驗組和對照組進行檢測，實驗組為滲透化處理的hADSCs加入抽提液，對照組為滲透化處理的hADSCs不加入抽提液。1.5hADSCs的轉歸

1.5.1 細胞形態(tài)的變化

處理后的hADSCs貼壁后，每2天換液1次，觀察培養(yǎng)7 d時實驗組和對照組細胞的形態(tài)變化。

1.5.2RT-PCR檢測K1/10及K19基因的表達

收集細胞后，依次行Trizol-氯仿抽提、異丙醇沉淀、乙醇洗滌，獲得細胞mRNA的混懸液。測OD值后，定量反轉錄成cDNA。PCR擴增后凝膠電泳顯示目的基因條帶，引物序列見表1。

表1K1/10、K19及β-actin基因引物序列Table 1Primer sequences of K1/10,K19 and β-actin genes

1.5.3 免疫熒光檢測細胞K1/10及K19的表達

抽提物處理后的hADSCs接種于放置滅菌蓋玻片的培養(yǎng)皿中，檢測時細胞爬片行免疫熒光檢測。一抗為K1/10及K19鼠抗人單克隆抗體（1∶200，Abcam公司，美國），二抗為羊抗鼠異硫氰酸熒光抗體。孵育結束后熒光顯微鏡觀察。

2 結果

2.1SLO處理hADSCs后細胞滲透率的變化

流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，SLO處理hADSCs后引起細胞的PI染色率明顯增加，約70%左右（圖1），說明SLO可以使細胞的通透率增加。

2.2 表皮細胞抽提物作用的hADSCs形態(tài)的變化

表皮細胞抽提物引入滲透化處理的hADSCs培養(yǎng)1 d后，細胞縮短，呈短梭形；誘導第7天，呈明顯鋪路石樣形態(tài)，而未加抽提液的細胞仍為梭形（圖2）。

2.3 抽提物作用于hADSCs后K1/10及K19基因mRNA表達

以表皮細胞為陽性對照，RT-PCR檢測結果顯示7 d時加入表皮細胞抽提物的hADSCs的K1/10及K19基因表達陽性，對照組則為陰性（圖3）。

2.4 抽提物作用的hADSCs表達表皮細胞標志

hADSCs與表皮細胞抽提物共孵育后培養(yǎng)7 d，免疫熒光檢測K1/10、K19的表達。在實驗組中，K1/10和K19有較明顯表達，而對照組則無表達（圖4）。

圖1SLO處理后脂肪干細胞滲透性的改變A:The permeability rate of ADSCs without SLO dispose B:The permeability rate of ADSCs with SLO disposeFig.1The ADSCs permeability changes after SLO dispose

圖2 細胞形態(tài)學改變A:Cell morphology of SLO-permeating ADSCs without cell extract at the 7th day;B:Cell morphology of SLO-permeating ADSCs adding cell extract at the 7th day(40×)Fig.2Cell morphological changes

圖3 細胞處理后7 d時細胞K1/10及K19基因表達的變化Fig.3Gene expression of K1/10 and K19 seven days after cell operation

圖4 細胞處理后7 d時K1/10及K19的表達（40×）Fig.4K1/10 and K19 protein expression in the cell membrane 7 days after cell operation(Immunofluorescent,40×)

3 討論

經典的重編程是將供體細胞核轉入卵細胞內，利用其細胞內微環(huán)境對供體細胞基因表達進行重編程，從而使新細胞獲得全能分化性[5-6]。另外，將體細胞同胚胎干細胞或生殖干細胞融合后，也可對此體細胞進行重編程，得到全能分化細胞[7-8]。研究已證實，卵細胞、干細胞及終末分化的體細胞內均存在著相似的染色質重編程物質，可以調節(jié)其他細胞使其發(fā)生形態(tài)學、基因學變化[9]。隨著研究的深入，含有重編程所需的啟動物質的細胞抽提液逐漸成為重編程方面的研究熱點。

Hakelien等[1]于2002年首次將T細胞的抽提物導入成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞下調其固有基因的表達，而表達T細胞特異的基因、特定的表面分子和功能。Gaustad等[3]報道，將小鼠的心肌細胞抽提物加入ADSCs中，可以使ADSCs表達心肌細胞的特異性標志，甚至有些轉化的細胞可以出現(xiàn)自律性搏動。同年，Hakelien等[2]將胰島β細胞抽提物同成纖維細胞共培養(yǎng)，可使成纖維細胞表達胰島β細胞的表型。由此可見，細胞抽提物重編程模式是一種有效模式，可發(fā)生在干細胞與體細胞之間或體細胞與體細胞之間。此方法中所用細胞來源于同一個體，避免了卵細胞重編程的倫理學爭議。

在重編程實驗中，供體細胞為有一定分化潛能的間充質干細胞或成纖維細胞。ADSCs是成體間充質干細胞中具有多向分化潛能的一類細胞群[10]。ADSCs具有多向分化潛能，在體外可大量擴增，并且在適當?shù)恼T導條件下分化為成脂細胞、成骨細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞等[10-11]，所以極有潛力作為重編程的受體細胞。此外，脂肪抽吸術是常見手術，脂肪組織的來源極為方便，這也是我們選擇ADSCs作為受體細胞的原因。

SLO對黏附和非黏附細胞均具有成孔毒性，處理過的細胞允許小于100 KDa的分子進入細胞[12]。在本實驗中，SLO處理細胞后允許抽提物、ATP生成系統(tǒng)等進入細胞中發(fā)揮作用。脂肪干細胞與表皮細胞抽提物孵育后培養(yǎng)，細胞形態(tài)發(fā)生改變：1 d時，細胞開始縮短；7 d時，出現(xiàn)典型的表皮細胞的鋪路石樣形態(tài)。此外，ADSCs與表皮細胞抽提物孵育后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)ADSCs表達表皮細胞標志性的角蛋白K1/10及K19的基因，并表達相應的細胞膜蛋白。但是培養(yǎng)至14 d時，相應的檢測均無陽性表現(xiàn)，可能是因為重編程不能使所有的ADSCs發(fā)生變化，剩余的未被重編程的ADSCs的優(yōu)勢生長抑制了已發(fā)生重編程的ADSCs的生長。但從上述結果可初步證實，表皮細胞抽提液在一定的時間內可以特異性的開放或者關閉ADSCs的某些基因，使其向表皮細胞方向分化。

細胞抽提物中的重編程物質的本質迄今未有答案。目前認為，抽提物中的有效成分可能是轉錄因子或者DNA結合蛋白[13]。無論在T淋巴細胞抽提物對293T細胞的重編程，還是在胰島β細胞抽提物對成纖維細胞的重編程，均觀察到細胞核對相應基因轉錄因子的攝取[1－2]。另外，在實驗中也觀察到H4或H3組蛋白乙?；癄顟B(tài)的改變[1－14]，但研究表明這種改變是暫時的[4]。目前，細胞重編程的始動物質是什么，重編程的機制是什么，均無明確答案，都需要進一步探索。

細胞抽提物重編程可以給我們提供新的細胞來源，但是步驟有待于進一步簡化，現(xiàn)在的較為繁冗的步驟使操作易污染，不易控制。隨著實驗技術的不斷革新，我們相信利用表皮細胞抽提物重編程ADSCs后可以得到大量的表皮細胞，并能夠被廣泛地應用于實驗研究中，從而加速其臨床應用的步伐。

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Reprogramming of Adipose Tissue Derived Stem Cells Using Nuclear and Cytoplasmic Extract of Epidermal Cells

ObjectiveTo explore if cell extract of epithelial cells could reprogram adipose tissue derived stem cells (ADSCs)and make them turn to epithelial cells.MethodsCell extract of epithelial cells was obtained by ultrasonic emulsification and high speed centrifugation,and then was frozen for further use.P2/3 ADSCs were treated with SLO,and then the cell extract was added into the cells.Seven days later,morphological changes of ADSCs,mRNA and membrane protein expression changes of keratin K1/10 and K19 in ADSCs were observed through RT-PCR and immunofluorescent. ResultsSLO-treated ADSCs got high permeability,up to 70%.7 days later,the ADSCs adding cells extract became typical madstones-like shape of epithelial cells,mRNA and protein expression of keratin K1/10 and K19 were positive in these cells.Conclusion Cell extract of epithelial cells could reprogram ADSCs into epithelial cells.

Adipose tissue derived stem cells;Epidermal cells;Cell extract;Reprogramming

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）03－0129－04

TANG Xinjie,XIE Feng,SONG Nan,ZHANG Qun.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Qun(E-mail：qunzhang737@sina.com).

2011年3月21日；

2011年4月16日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.002

國家自然科學基金（30772263，81071580），2010年中華醫(yī)學會－歐萊雅中國人健康皮膚/毛發(fā)研究項目、上海高校創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃。

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。

張群(E-mail：qunzhang737@sina.com)。