大蒜SOD酶的分離純化和肝素修飾

楊華，周小苗，方亞東，郭純，龔銀，曹杏芝

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410007）

SOD是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種含金屬酶，它催化超氧自由基O-2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和O2的歧化反應，在防御生物體免受超氧自由基損傷、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、及延緩機體衰老等方面都具有重要作用，近年來受到生化界及醫(yī)藥界的普遍關注[1-3]。但天然SOD穩(wěn)定性差，SOD在體內(nèi)半衰期為6～15 min，因此，限制了其在食品、保健品、藥品等方面的應用[4]。本項研究從大蒜中提取SOD酶，以肝素為修飾劑，對大蒜SOD酶進行共價修飾，以期獲得高穩(wěn)定性的修飾SOD，為大蒜SOD的應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

大蒜（Allium sativum L.）球莖購自湖南農(nóng)大農(nóng)貿(mào)市場，25℃發(fā)芽2～5 d。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜SOD的提取將發(fā)芽大蒜用大量清水沖洗，再用蒸餾水洗凈，濾紙吸干后稱取約50 g加入pH值7.8、0.05 mol/L的磷酸緩沖液200 mL（內(nèi)含0.001 mol/L的EDTA），用組織搗碎機勻漿，再用超聲波破碎10 min，然后以4000 r/min離心20 min得上清液，測體積。上清液即為大蒜SOD的粗提取液[5-6]。

1.2.2 大蒜SOD活性的測定方法采用鄰苯三酚自氧化法[7-8]。以每毫升反應液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 選擇加熱溫度實驗試管中加入適量大蒜SOD粗提取液，分別在50、55、60、65、70、75、80℃水浴中加熱20 min，然后4000 r/min離心20 min，上清液即為SOD粗純化液。測定酶活和蛋白含量。

1.2.5 硫酸銨分級沉淀實驗按照粗提液的體積查出0℃下達到一定飽和度所需硫酸銨的質(zhì)量。將硫酸銨晶體研磨成白色粉末后，稱取一定質(zhì)量的硫酸銨粉末緩慢加入SOD粗提液中，使之達到40%的飽和度，再放置4℃冰箱1 h，然后8000 r/min冷凍離心20 min，除去沉淀雜蛋白，取上清液。在上清液中再加硫酸銨粉末使之達到80%飽和度，放置于4℃冰箱2 h，然后8000 r/min冷凍離心20 min，收集沉淀。用緩沖液A（10 mmol/L磷酸緩沖液，pH值7.8）溶解，然后在相同緩沖液中充分透析，離心去除不溶性沉淀。量透析液體積，測定酶活和蛋白含量。

1.2.6 微晶纖維素層析純化SOD酶稱取15～20 g微晶纖維素粉末，懸浮于200 mL含1%Tween 20的水溶液中，置于磁力攪拌器上攪拌1～2 h，靜置片刻，棄去懸浮雜質(zhì)，抽濾，用蒸餾水充分沖洗干凈后懸浮于200 mL醋酸緩沖液（0.01 mol/L，pH值4.0），于4℃環(huán)境中裝柱（2 cm×20 cm），以醋酸緩沖液徹底平衡柱子。將透析液上樣于平衡好的微晶纖維素柱，繼續(xù)用4倍柱體積的醋酸緩沖液洗脫柱子，然后分別用含0.1和0.2 mol/L NaC1的醋酸緩沖液階段洗脫柱子，收集活性組分[9]。

1.2.7 肝素修飾大蒜SOD酶稱取純化的大蒜SOD溶于0.01 mol/L濃度的Tris緩沖液，加入一定比例的活化肝素，于4℃反應20 h，用甘氮酸終止反應，反應液濃縮后上纖維素層析柱，經(jīng)洗脫收集具有SOD活力組分，即得修飾SOD酶。修飾的SOD酶以纖維素層析純化的SOD酶為對照進行SDSPAGE檢測和保持穩(wěn)定性分析[10-13]。

2 結(jié)果及分析

2.1 加熱溫度對大蒜SOD酶學特性的影響

分別測定不同處理溫度加熱獲得的純化液中SOD酶的活力及蛋白質(zhì)含量，計算SOD比活力，結(jié)果如圖1。

圖1 溫度和SOD酶活性及比活力的關系

從圖1可以看出隨著加熱溫度上升，大蒜SOD酶的活性會下降。而且溫度達到80℃時，酶活力損失較多，超過30%。而隨著溫度上升，大蒜SOD酶的比活力會較快上升。但超過75℃時，酶的比活力反而會下降。其原因是SOD酶熱穩(wěn)定性較好，溫度上升初期，其他的蛋白變性沉淀，SOD酶比活力表現(xiàn)為增加；而溫度過高時，SOD酶的穩(wěn)定性下降，損失了酶活力，比活力下降。在70～75℃間，酶的活力及比活力大致相當。從能量等方面考慮，建議熱處理純化SOD酶蛋白的溫度采用70℃。

2.2 大蒜SOD酶的纖維素層析

經(jīng)熱處理和鹽析的酶樣品上纖維素層析柱進行梯度洗脫。梯度洗脫的起始緩沖液為0.1mol/L的NaCl醋酸緩沖液，終止緩沖液為0.2 mol/L的NaCl醋酸緩沖液。收集洗脫液，測定蛋白質(zhì)含量及SOD酶活性（見圖2）。檢測發(fā)現(xiàn)，酶活力在峰Ⅰ和峰Ⅲ都有出現(xiàn)，而主要集中在峰Ⅲ。

圖2 纖維素層析SOD洗脫曲線

2.3 大蒜SOD酶分離純化的結(jié)果

大蒜SOD酶提取液經(jīng)70℃加熱20 min，取上清液在4℃條件下先使硫酸銨的飽和度達到40%。除雜后調(diào)整硫酸銨飽和度達到80%，取沉淀透析，透析液經(jīng)纖維素層析。分離純化的效果見表1。

從表1可以看出，在純化的過程中酶活力不斷地被損失，而比活力不斷增加。經(jīng)過熱變性、硫酸銨分級鹽析和纖維素柱層析3步，酶的純度增加了356.7倍。而纖維素柱層析的純化效果更加顯著。

表1 大蒜SOD的分離純化結(jié)果

2.4 大蒜SOD酶肝素修飾效果

對經(jīng)過肝素修飾的大蒜SOD酶進行SDSPAGE檢測，檢測結(jié)果如圖3。從圖3可以看出，經(jīng)纖維素層析的樣品在電泳時只有一條明顯的條帶（圖3-1），說明大蒜SOD原酶液經(jīng)過熱處理、鹽析及層析等純化步驟可以得到比較純凈的SOD酶樣品。而在電泳時，經(jīng)肝素修飾的SOD酶電泳遷移率小于SOD原酶。其主要原因在于肝素修飾是大分子結(jié)合修飾，肝素結(jié)合到SOD酶上，導致修飾的SOD酶分子量增大，電泳速度減慢。修飾的SOD酶經(jīng)穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明修飾的SOD酶在溶液中保存一星期，其酶活性可保持85%以上；而未修飾的SOD原酶液酶活性低于30%。

圖3 SDS-PAGE分析肝素修飾的SOD酶

3 討論

一般認為SOD酶穩(wěn)定性不強，但SOD酶比較耐熱。因此分離純化時可以采用熱變性的方式使其他不耐熱的蛋白變性沉淀，達到除雜的目標。而鹽析是酶分離純化經(jīng)常用到的技術，該技術能有效將目標蛋白和其他雜質(zhì)分開，而且能有效濃縮酶液。層析分離具有設備簡單、操作方便等特點，在實驗室和工業(yè)化生產(chǎn)中均廣泛應用。因此，選擇這3種技術分離純化大蒜SOD酶，試驗結(jié)果表明這3種技術組合能有效分離純化SOD酶。

微晶纖維素層析能有效純化大蒜SOD酶，但由于微晶纖維素顆粒太小，在洗脫時洗脫液流速過慢，效率很低。如何提高洗脫速度是工業(yè)化生產(chǎn)時值得考慮的一個問題。另外應用微晶纖維素層析分離大蒜SOD酶時會出現(xiàn)兩個酶活性峰，這可能是大蒜SOD酶存在同工酶的形式。

SOD是一種重要的氧自由基清除劑，但其半衰期比較短，從而限制了它在臨床上的應用。對酶進行化學修飾是克服這一缺點的途徑之一，國內(nèi)外對此作了大量工作，并取得了一定效果。在眾多大分子修飾劑中，PEG應用最為廣泛。但考慮到肝素為動物體內(nèi)水溶性酸性粘多糖，具有抗凝血、抗血栓及降血脂等活性，經(jīng)肝素修飾的SOD酶可能既有清除氧自由基的活性又有抗凝血的活性，醫(yī)藥價值更大，因此選擇了肝素作為大分子修飾劑。

[1]SeguíJ,Gironella M,Sans M,et al.Superoxide dismutase ameliorates TNBS-induced colitis by reducing oxidative stress,adhesion molecule expression,and leukocyte recruitment into the inflamed intestine.J.Leukoc.Biol..September 2004,76（3）:537-544.

[2]Campana,F.Topical superoxide dismutase reduces post-irradiation breast cancer fibrosis.J.Cell.Mol.Med..2004,8（1）:109－116.

[3]Vozenin-Brotons M C,Sivan V,Gault N,et al.Antifibrotic action of Cu/Zn SOD is mediated by TGF-beta1 repression and phenotypic reversion of myofibroblasts[J].Free Radic Biol Med.Elsevier.2001,30（1）:30-42.

[4]郭勇.酶工程（第二版）[M].北京:科學出版社，2007.

[5]王雪峰，沈頌東，迮玉官，等.大蒜超氧化物歧化酶的分離純化及其性質(zhì)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2001，29（3）:408-409.

[6]孫永君.大蒜中SOD的提取研究[J].化學與生物工程學報，2005，（10）:23-25.

[7]李永利，張焱.鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志.2000，l0（6）:673.

[8]萬軍，黃國鈞，周霞.鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性中檢測波長的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，（14）:7315-7315，7381.

[9]楊學山，楊孝樸，楊志杰，等.離子交換層析法純化羊血SOD及其穩(wěn)定性研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2010，45（5）:157-160.

[10]柳建平.皺皮木瓜超氧化物歧化酶分離純化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（1）:222-223.

[11]柳建平，羅安才.青梅果超氧化物歧化酶粗酶的提取及活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，（19）:9126-9127，9170.

[12]楊莉，楊萍，申虹，等.超氧化物歧化酶修飾前后的瑟定性比較[J].鄭州工程學院學報，2003，24（1）:68-70.

[13]劉向勇，張小華，單長民，等.超氧化物歧化酶在釀酒酵母堿脅迫抗性中的功能研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，（26）:14277-14278.