HPLC-ELSD法測(cè)定穿山龍中薯蕷皂苷元的含量

李艷榮，李 強(qiáng)，洪 霞，潘海峰

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000；2.寬城縣醫(yī)院）

HPLC-ELSD法測(cè)定穿山龍中薯蕷皂苷元的含量

李艷榮1，李 強(qiáng)2，洪 霞1，潘海峰1

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000；2.寬城縣醫(yī)院）

目的:建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD）測(cè)定穿山龍中薯蕷皂苷元含量的方法。方法:使用Agilent Eclipse C18(150×4.6mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水(95：5），柱溫：40℃，流速1.0ml/min；蒸發(fā)光檢測(cè)器以N2為載氣，載氣壓力3.5bar，漂移管溫度為70℃。結(jié)果:薯蕷皂苷元在2.04-0.255mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9996），方法重復(fù)性好，平均回收率為98.9%(RSD=1.4%）。結(jié)論:該方專屬性強(qiáng)、靈敏、準(zhǔn)確，可作為穿山龍的質(zhì)量控制方法。

穿山龍；薯蕷皂苷元；高效液相色譜法；蒸發(fā)光檢測(cè)器

穿山龍是薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica Mak)的根莖，具有活血舒筋、消食利水、祛痰截瘧之功效，用于治療風(fēng)寒濕痹、慢性氣管炎、消化不良、勞損扭傷等[1]。民間多用穿山龍浸酒或煎服，治療筋骨麻木和腰酸腰痛。近年的研究證明，穿山龍有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病心絞痛、慢性氣管炎、慢性布魯菌病、脂肪瘤等，療效較好[2]。穿山龍中的薯蕷皂苷元是合成甾體激素的主要原料之一，藥用價(jià)值日益受到人們的重視[3]。薯蕷皂苷元為街烯醇，無(wú)共扼結(jié)構(gòu)，只在低波長(zhǎng)處有紫外吸收，因此采用常用的紫外檢測(cè)器定量靈敏度較低。本研究應(yīng)用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定穿山龍中薯蕷皂苷元的含量，靈敏、專屬性強(qiáng)，明顯提高了含量測(cè)定的準(zhǔn)確度。

1 儀器與試藥

美國(guó)Agilent 1200型液相色譜儀，Agilent G 4218A蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent Chemstation工作站；美國(guó)梅特勒-托利多AG245電子分析天平。穿山龍藥材(產(chǎn)于承德地區(qū)，見(jiàn)表1），由承德醫(yī)學(xué)院植化教研室趙春穎副研究員鑒定；薯蕷皂苷元對(duì)照品(批號(hào)：1539-200001），中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純），美國(guó)Fisher試劑公司；純凈水，娃哈哈；其余試劑均為分析純。

表1 穿山龍藥材樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱，Agilent Eclipse C18柱(150mm× 4.6mm，5μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：甲醇-水(95：5）；ELSD漂移管溫度：70℃；以N2做載氣，載氣壓力：3.5bar；Gain7，F(xiàn)ilter值：1；進(jìn)樣量：10μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱定薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，加甲醇制成2.04mg/ml的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成1.02mg/ml的對(duì)照品溶液。2

.2.2 供試品溶液的制備：精密稱定穿山龍藥粉1g，置250ml圓底燒瓶中，加入含3mol/L鹽酸的60%甲醇水溶液和石油醚(60-90℃）各50ml于沸水浴中加熱回流提取6h。反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，靜置分層，冷卻后，取上層石油醚相，下層再用石油醚萃取3次(每次50ml）合并萃取液，濃縮至干，用甲醇溶解并定容至5ml，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍考察：精密吸取薯蕷皂苷元對(duì)照品儲(chǔ)備液(2.04mg/ml），分別配制成含薯蕷皂苷元2.04、

1.52、1.02、0.51、0.255mg/ml的對(duì)照品溶液。各吸取10μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣濃度(mg/ ml)的自然對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：Y=1.162X+3.393（r=0.9996）。表明薯蕷皂苷元在2.04-0.255mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn)：取薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄薯蕷皂苷元的峰面積，得RSD為1.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一穿山龍供試品溶液(灤平縣），分別于制樣0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣，記錄薯蕷皂苷元的峰面積，得RSD為1.4%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一穿山龍樣品細(xì)粉(灤平縣）5份，按2.2.2的方法制備供試品溶液，測(cè)定薯蕷皂苷元的含量，得RSD為1.8%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗(yàn)：取同批穿山龍藥材(灤平縣）6份，每份約0.5g，精密稱定，分別加入薯蕷皂苷元對(duì)照品5.1mg，按2.2.2的方法制備供試品溶液，測(cè)定薯蕷皂苷元的含量，計(jì)算樣品回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，表明回收率結(jié)果符合分析方法的要求。

2.4 樣品含量測(cè)定 按2.1色譜條件，分別測(cè)定不同產(chǎn)地穿山龍中薯蕷皂苷元的含量，進(jìn)樣量10μl，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地穿山龍中薯蕷皂苷元含量測(cè)定結(jié)果(mg/g）

3 討論

本研究檢測(cè)承德市不同地區(qū)穿山龍藥材中薯蕷皂苷元的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)穿山龍中薯蕷皂苷元的含量雖有一定差異，但差別不大，表明承德市穿山龍藥材的質(zhì)量比較穩(wěn)定，在臨床用藥上有較好的可控性。

以往文獻(xiàn)[4-5]多采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定薯蕷皂苷元的含量，但薯蕷皂苷元屬于紫外末端吸收，多選擇203-210nm的紫外末端作為檢測(cè)波長(zhǎng)，在紫外末端檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相帶來(lái)的干擾會(huì)使檢測(cè)的靈敏度降低。本研究選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器作為檢測(cè)手段，對(duì)穿山龍中薯蕷皂苷元進(jìn)行分析，克服了在紫外末端檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相帶來(lái)的干擾，所得圖譜基線平直，靈敏度高，與雜質(zhì)有很好的分離度，提高了方法的專屬性，測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典I部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.188-189.

[2]丁曉林，李卿.中藥穿山龍的研究進(jìn)展[J].重慶中草藥研究，2003，48(2)：55-57.

[3]陳延鏞.甾體皂甙元的生產(chǎn)現(xiàn)狀[J].醫(yī)藥工業(yè)，1985，1(1)：32-37.

[4]韓菊，魏福祥，高曉霞，等.反相高效液相色譜法測(cè)定穿山龍中的薯蕷皂甙元[J].分析試驗(yàn)室，2009，28(4)：63-66.

[5]杜慶鵬，田金改，魄秀榮.高效液相色譜法測(cè)定穿山龍中薯菠皂昔元的含量[J].藥物分析雜志，2006，26(1)：14-16.

DETERMINATION OF DIOSGENIN CONTENT IN DIOSCOREA NIPPONICA MAKINO BY HPLC-ELSD

LI Yan-rong, LI Qiang, HONG Xia, et al
(Institude of Chinese Materia, Chengde Medical College, Hebei Chengde, 067000)

Objective:To establish a testing method for determination of diosgenin content in Dioscorea nipponica Makino by PHLC-ELSD.Methods:Agilent Eclipse C18(150mm×4.6mm, 5μm)column and evaporated light scattering detector (N2as carrier gas, pressure: 3.5bar, drift tube temperature: 70℃) were used in this study. Mobile phase was methanol-water (95:5) at 40℃, flow rate was 1.0ml/min.Results:Diosgenin had better linear rate at 2.04-0.255mg/ ml (r=0.9996), the average recovery was 98.9% (RSD=1.4%); and this PHLC-ELSD method had better repeatability.Conclusions:This method for detecting diosgenin content in Dioscorea nipponica Makino by PHLC-ELSD is specific, sensitive and accurate, can be acted as effective method for quality control of Dioscorea nipponica Makino.

Dioscorea nipponica Makino; Diosgenin; HPLC; Evaporated light scattering detector

R917

A

1004-6879(2011）02-0126-03

2010-11-29）