茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

莊哲煌，蔡漢權(quán)，陳丹生

（韓山師范學(xué)院生物系，廣東潮州，521041）

茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

莊哲煌，蔡漢權(quán)，陳丹生

（韓山師范學(xué)院生物系，廣東潮州，521041）

以茉莉花（Jasminum sambac）花瓣為外植體在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，通過對其類型的篩選從中選擇疏松愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)后，初步建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系。結(jié)果表明，不同激素可誘導(dǎo)出疏松型（CA）、泥狀型（CB）和綠色塊狀型（CC）愈傷組織，其分化方向也不同。用CA型和CB型愈傷組織均能建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系，其中以泥狀愈傷組織為起始材料較佳，大約11 d可建立初步的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系。

茉莉花；愈傷組織；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

茉莉花 （Jasminum sambac）屬木犀科素馨屬植物，常綠攀緣灌木，茉莉鮮花瓣中含芳香油0.2%～0.3%，主要成分是苯甲醇及其酯類，可以制作香精并應(yīng)用于日?；瘖y品、洗滌用品和食用香精中[1]。因市場需求提高，從而帶動了人們對茉莉花的栽培和香精油提取的研究，如《茉莉栽培淺談》[2]、《茉莉花的化學(xué)成分》[3]，其產(chǎn)品市場已趨成熟。但是，目前各種提取方法都需將整朵花進行破壞，茉莉花香精油提煉效率較低[1]并受季節(jié)限制，制約了茉莉香精提取業(yè)的發(fā)展。如果能運用細(xì)胞工程手段，利用細(xì)胞大量培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物分離，提高茉莉花香精油的提取效率，同時避免盛花季節(jié)對工業(yè)生產(chǎn)帶來的影響，那么將對今后茉莉花的生產(chǎn)與利用具有重要的意義。

通過懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物以促進工業(yè)化生產(chǎn)，是現(xiàn)代生物工程技術(shù)迅速發(fā)展的一個方向。目前至少已在200種植物上生產(chǎn)500種以上的有用成分[4]，如白雪芳等[5]、蔡漢權(quán)等[6]、林龍云等[7]、李玲等[8]、Chen等[9]、Liang等[10]、Tang等[11]分別在三尖杉、羅勒、太子參、野葛、煙草（tobacoo）、苦楝樹（neem tree）、人參（panax ginseng）等植物的懸浮培養(yǎng)中闡述了愈傷組織的形成、懸浮培養(yǎng)系的建立及其產(chǎn)物的研究。茉莉花組織培養(yǎng)方面的研究很少，江明等[12]在1994年報道了《大花茉莉的組織培養(yǎng)和植株再生》，而茉莉花瓣誘導(dǎo)愈傷組織及其懸浮細(xì)胞培養(yǎng)則未見報道。因此本文通過研究茉莉花花瓣誘導(dǎo)愈傷組織和建立茉莉花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系的方法，為進一步應(yīng)用于原生質(zhì)體分離、細(xì)胞培養(yǎng)、次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茉莉花（Jasminum sambac）花苞內(nèi)層的花瓣。

1.2 試驗方法

①取材和消毒 從校園花圃采集茉莉花花苞，將整個花苞連同花托、花柄一起剪下，于肥皂水中浸泡30 min。接種前將花托去掉、整個花苞置于0.1%的HgCl2溶液中浸泡8 min，后將花苞撈出，用無菌水清洗3～4次，置于無菌吸水紙上。接種時將花苞切開，除去外2層花瓣，取內(nèi)部花瓣平貼于培養(yǎng)基上，每瓶接種3～4個花瓣。

②愈傷組織的誘導(dǎo) 將花瓣接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（BK1、BK2、BK3、BK4、BK5、BK6），誘導(dǎo)出愈傷組織后選擇BK5培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)2 w。調(diào)整激素配比，用分化培養(yǎng)基（F1、F2、F3、F4、Y1、Y2、Y3、Y4）誘導(dǎo)并篩選各種類型的愈傷組織。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基BK1：MS+6-BA 0 g/L+NAA 0 g/L；BK2：MS+6-BA 0.2 g/L+NAA 0.2 g/L；BK3：MS+6-BA 0.5 g/L+NAA 0.2 g/L；BK4：MS+6-BA 1 g/L+NAA 0.2 g/L；BK5：MS+KT 1 g/L+2，4-D 1 g/L；BK6：MS+KT 1 g/L+2，4-D 2 g/L。繼代培養(yǎng)基BK5：MS+KT 1 g/L+2，4-D 1 g/L。分化培養(yǎng)基F1：MS+KT 0.5 g/L+2，4-D 0.2 g/L；F2：MS+ KT 0.5 g/L+2，4-D 0.5 g/L；F3：MS+KT 0.5 g/L+2，4-D1 g/L；F4：MS+KT 0.5 g/L+2，4-D 2 g/L。Y1：MS+6-BA 0.2 g/L+NAA 0.2 g/L；Y2：MS+6-BA 0.5 g/L+NAA 0.2 g/L；Y3：MS+6-BA 1 g/L+NAA 0.2 g/L；Y4：MS+6-BA 2 g/L+ NAA 0.2 g/L。

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)情況

培養(yǎng)基配制條件：附加蔗糖30 g，瓊脂9.2 g/L，pH值5.8～6.0，121℃高壓滅菌20 min。

外植體培養(yǎng)條件：溫度23～27℃，光照強度1 500 lx，光周期12 h/d。

③茉莉花花瓣懸浮細(xì)胞系的建立 經(jīng)過分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)，愈傷組織出現(xiàn)了不同的生長、分化情況，其中F3培養(yǎng)基能誘導(dǎo)出泥狀愈傷組織。將F3培養(yǎng)基去除瓊脂，其液體培養(yǎng)基F5作為懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基。

F5：MS+KT 0.5 g/L+2，4-D 1 g/L的液體培養(yǎng)基，其蔗糖濃度為30 g/L，pH值5.8～6.0，配制后分裝于100 mL三角錐形瓶中，每瓶裝培養(yǎng)基20 mL，121℃滅菌20 min，備用。

將CA、CB和CC 3種類型的愈傷組織分別接入F5培養(yǎng)基，接種量為每瓶0.3～0.5 g，每種材料接種8瓶。將其在超凈工作臺上無菌接種后置于搖床上進行液體振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度28℃，弱光150 lx，光周期12 h/d，振蕩速度為120 r/min。接種5 d后第一次鏡檢，并進行繼代，即吸取渾濁但無較大組織塊的液體培養(yǎng)基接入新鮮F5培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，直至形成分散、快速生長的懸浮細(xì)胞系。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)與分化結(jié)果

①不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)茉莉花瓣在BK1～BK66種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，開始出現(xiàn)變化，20 d后統(tǒng)計其愈傷組織的誘導(dǎo)數(shù)，結(jié)果見表1。

BK1～BK4這4種培養(yǎng)基中的花瓣于12 d后開始出現(xiàn)膨大，瓣沿出現(xiàn)顆粒狀鼓起，后顏色由白轉(zhuǎn)黃，停止變化，最終啟動失敗，無愈傷組織出現(xiàn)。

表1中BK5于10～12 d后開始出現(xiàn)乳白色愈傷組織，且細(xì)胞擴展迅速。BK6于15 d后開始出現(xiàn)白色愈傷組織，擴展速度一般。而將BK5繼代10～12 d后接入8種分化培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)，愈傷組織出現(xiàn)綠色、黃綠色、淺綠色、乳白色、黃白色和褐色；塊狀、泥狀、粒狀等不同分化類型（表2）。在繼代過程中，CA型與CB型部分出現(xiàn)黃色分泌物（圖1），初步推測為其代謝產(chǎn)物，這與本試驗的研究目的與方向相符。也由此說明，激素類型的選擇與搭配對愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著影響，KT與2，4-D的組合明顯優(yōu)于6-BA與NAA的組合。BK5：MS+KT 1 g/L+2，4-D 1 g/L是茉莉花瓣愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基。

圖1 愈傷組織產(chǎn)生的黃色代謝產(chǎn)物

表2 不同培養(yǎng)基下愈傷組織的分化情況

圖2 CB型愈傷組織涂片：分散的單細(xì)胞及小細(xì)胞團

圖3 CB型懸浮細(xì)胞：分散性良好

圖4 CB型懸浮細(xì)胞：分散性好，分裂快

②愈傷組織類型的分化。選擇BK5培養(yǎng)出的愈傷組織，接入8種分化培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)，經(jīng)過30 d進行統(tǒng)計，結(jié)果出現(xiàn)CA型、CB型和CC型3種具有代表性的愈傷組織（表2）。

CA型為疏松型愈傷組織，以黃色為主，少數(shù)淺綠色、松散易夾碎，含有一定水分，亦稱沙狀。

CB型為泥狀愈傷組織，以乳白色為主，表面濕潤。其細(xì)胞活力強、生長迅速，非常松散，含水分最多。繼代培養(yǎng)時在固體培養(yǎng)基上將其平鋪攤開，再挑去大塊的愈傷組織，經(jīng)過2～3次繼代后就能得到微粒狀愈傷組織，即是泥狀。將此愈傷組織在玻片上作涂片，可見單細(xì)胞及小細(xì)胞團（圖2）。

CC型為塊狀愈傷組織，綠色或黃綠色，難夾碎需用刀切開，水分很少，表面有綠色顆粒狀突起，有誘導(dǎo)芽的能力，試驗過程中已從CC型愈傷組織誘導(dǎo)出根。

3種愈傷組織相比，CB型愈傷組織最為松散，適合作為建立懸浮細(xì)胞系的起始材料，CA型和CC型則作為對比材料。

由此可見，激素類型和濃度對愈傷組織的生長、分化有明顯影響，低濃度（F1，Y1）下愈傷組織生長慢，繼代周期較長，狀態(tài)為粒狀和塊狀；高濃度（F4，Y4）下愈傷組織易出現(xiàn)變褐、變硬等老化現(xiàn)象。說明F3：MS+KT 0.5 mg/L+2，4-D 1 mg/L適宜愈傷組織培養(yǎng)及分化。

2.2 茉莉花愈傷組織類型對懸浮細(xì)胞系建立的影響

分別將已繼代的CA型、CB型和CC型愈傷組織接入20 mL的F5培養(yǎng)液，每瓶0.3～0.5 g，比較愈傷組織類型對懸浮細(xì)胞建立的影響。

結(jié)果表明，在接入CB型愈傷組織5 d后，懸浮液中有較多的單細(xì)胞和小細(xì)胞團出現(xiàn)。此時，盡量避免大塊愈傷組織，吸取部分渾濁液接入相同的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，6 d后可獲得分散性良好的懸浮細(xì)胞系（圖3）。鏡檢表明，CB型愈傷組織所建立的懸浮細(xì)胞系需時較短，大概11 d，細(xì)胞分裂快、分散性好，整體生長迅速（圖4）。相比較之下，接入CA型愈傷組織振蕩培養(yǎng)5 d后，懸浮液的主要組成還是細(xì)胞團，繼代5 d后再鏡檢，才看到少數(shù)的單細(xì)胞和較多的小細(xì)胞團。而CC型愈傷組織是塊狀愈傷組織，只能切取其表面的顆粒狀愈傷組織接入，培養(yǎng)10 d后鏡檢，只出現(xiàn)極少的小細(xì)胞團，再經(jīng)過10 d的培養(yǎng)，也只能得到少數(shù)的幾個單細(xì)胞，培養(yǎng)液中依舊為大塊培養(yǎng)物，懸浮培養(yǎng)失敗。

由此可見，愈傷組織類型對建立懸浮細(xì)胞系有明顯影響，CA型和CB型愈傷組織均可建立懸浮培養(yǎng)系，以CB型培養(yǎng)基為佳，而CC型為塊狀愈傷組織，不適合作為懸浮培養(yǎng)的起始材料。

3 小結(jié)與討論

3.1 影響愈傷組織成功誘導(dǎo)的因素

本試驗?zāi)艹晒φT導(dǎo)出愈傷組織，進而完成后邊一系列試驗，與培養(yǎng)基激素密切相關(guān)，同時外植體的取材和消毒也十分重要。

①培養(yǎng)基激素類型 呂冬霞等[13]認(rèn)為，多數(shù)情況下，單獨使用2，4-D就可以成功誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生，但容易受濃度高低的影響。生長素和細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的快速生長是非常必要的，特別是二者有效結(jié)合時，能更強烈地刺激愈傷組織的形成。本試驗證明，激素類型的選擇與搭配對愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著影響，KT與2，4-D的組合是成功誘導(dǎo)愈傷組織形成的關(guān)鍵。而從2，4-D濃度的選擇及結(jié)果來看，與張素勤等[14]對非洲菊葉片愈傷組織的誘導(dǎo)試驗結(jié)果相同，誘導(dǎo)愈傷組織因生長素種類不同，所需濃度也不同。2，4-D以1.0 mg/L誘導(dǎo)效果最好，濃度升高，產(chǎn)生的愈傷組織量減少，而濃度降低，誘導(dǎo)率則下降。

②取材與消毒 在采集茉莉花花苞時，應(yīng)盡量選擇膨大的即將開放的色澤乳白或米黃，無破損或裂縫的花苞，若破損或裂縫易受到污染或因消毒而被破壞。幼小花苞的花瓣容易枯萎或褐變，不宜作為外植體。消毒過后要用無菌水沖洗徹底，避免切開花苞后殘余消毒液對內(nèi)層花瓣的傷害，導(dǎo)致外植體褐變或枯萎。

3.2 茉莉花懸浮細(xì)胞系建立的關(guān)鍵因素

本試驗?zāi)茉?0～11 d成功建立茉莉花懸浮細(xì)胞系，原因在于誘導(dǎo)出了CB型泥狀愈傷組織。CB型愈傷組織松散度高，細(xì)胞分裂快、生長快，是建立懸浮細(xì)胞系的較佳材料。另一個成功因素則是選擇了合適的培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基F5是從F3培養(yǎng)基去掉瓊脂而來，而F3培養(yǎng)基培養(yǎng)出了泥狀愈傷組織，說明其成分適合泥狀愈傷組織的生長，因此，F(xiàn)5也適用于懸浮培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)泥狀愈傷組織，讓其更松散地生長和分裂。

3.3 CA型、CB型產(chǎn)生的黃色物質(zhì)

在CA型、CB型愈傷組織的繼代、培養(yǎng)過程中，部分組織塊切口出現(xiàn)黃色物質(zhì)，經(jīng)鏡檢并非外侵細(xì)菌，因此初步推測為其次生代謝產(chǎn)物，由細(xì)胞分泌出來。當(dāng)然，在建立懸浮細(xì)胞系的過程中，液體培養(yǎng)基本是無色透明的，在接入愈傷組織5～6 d后亦會變渾濁同時淡黃化。這種現(xiàn)象除細(xì)胞團的增多外，也與分泌出的黃色物質(zhì)融于培養(yǎng)基中有關(guān)。這些次生代謝物是不是試驗最終想得到的茉莉花油，其含量又如何，有待進一步的研究和檢驗。

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Jasminum sambacCallus Induction and Suspension Cell Culture

ZHUANG Zhehuang,CAI Hanquan,CHEN Dansheng
(Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou,Guangdong 521041)

Petals of Jasminum sambacwere induced and cultured callus on the media with different phytohormones concentration.The preliminary stable suspension culture system was established after choosing the loose callus from different types for cell suspension culture.The results indicated that different phytohormones could form three types of callus,CA, CB and CC which had diverse polarization direction.Both the CA and CB callus could be used as initial materials for establishing suspensions,and it took about 11 days to establish cell suspensions from the better callus,CB callus.

Jasminum sambac;Callus;Cell suspension culture

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.08.007

韓山師范學(xué)院重點科研項目（2005-413545）

莊哲煌（1984-），男，助教，本科，從事植物組織培養(yǎng)的教學(xué)與研究工作，電話：0768-2317422，E-mail：zzh@hstc.edu.cn

2011-03-15